肌源干细胞治疗周围神经损伤的研究进展

刘志鑫，张洪雨，刘建宇

(哈尔滨医科大学第二附属医院 骨外一科,黑龙江 哈尔滨　150081)



肌源干细胞治疗周围神经损伤的研究进展

刘志鑫，张洪雨，刘建宇

(哈尔滨医科大学第二附属医院 骨外一科,黑龙江 哈尔滨150081)

[摘要]周围神经损伤是常见的外科疾病之一，为了寻求促进周围神经损伤修复的途径，临床医生和科学工作者长期致力于提高外科技术和改进手术方法，但术后功能恢复仍不如意。近年来飞速发展的组织工程学为此提供了一种新的解决途径，其中雪旺细胞目前被认为是周围神经损伤修复中重要的种子细胞，但其很多方面的应用都受到限制。所以，需寻找雪旺细胞的替代细胞。近年来被发现并逐渐成为研究热点的新型种子细胞之一便是肌源干细胞(muscle- derived stem cell，MDSC)。在本文中作者通过大量阅读相关文献，并结合自己的相关实验经验，对肌源干细胞诱导分化治疗周围神经损伤的理论依据、实验方法、新突破及面临的问题进行综述。

[关键词]肌源干细胞； 神经营养因子； 雪旺细胞； 周围神经损伤

周围神经损伤是因某些因素造成神经轴索中断或神经断裂、神经传导功能障碍，致使躯干及四肢感觉、运动、交感功能障碍的一类临床病症。其病理变化为被损伤神经远端发生Wallerian变性[1]，近端一个或多个郎飞节也发生相似的病理变化，然后雪旺细胞(Schwann cells，SCs)增殖，其在神经膜管内排列有序并形成一条实心的细胞索Bungner带[2]，同时Bungner带内有再生的轴突长入，紧接着大多数SCs凋亡，小部分存活的SCs开始与轴突1∶1匹配并包绕轴突形成髓鞘，再生的轴突逐渐延伸至效应器，从而重新建立新的突触联系[3]。

1对SCs作用的认识及研究

SCs在周围神经损伤后的修复中具有重要作用，为周围神经系统(PNS)特有的神经胶质细胞。成年哺乳动物的中枢神经系统(CNS)损伤后，极少自发地发生结构和功能的再生，主要由于自身的微环境不利于再生，如少突细胞髓鞘套管的存在和胶质瘢痕形成等[4]。而PNS被损伤后可再生，其神经功能也可部分甚至全部恢复，这主要依赖于一个适宜神经再生的微环境，而这个微环境正是由SCs 提供的。据文献报道，当CNS损伤后，将SCs 移植到其损伤部位可以使CNS再生[5]。因此改造CNS的微环境，使之接近于PNS，目前已成为促进CNS再生的重要策略之一。SCs促进神经再生的机制主要有以下几方面：(1) 激活免疫反应，具有免疫吞噬作用；(2) 增殖迁移，引导轴突再生；(3) 分泌作用：分泌神经营养因子、细胞外基质分子及细胞黏附分子等；(4) 趋化作用；(5) 神经纤维与 SCs之间形成紧密连接；(6) 形成神经髓鞘等。故将SCs移植到周围神经内，其可存活，并通过增殖、迁移、分化及分泌多种神经营养因子等促进轴突和髓鞘再生及形成，进而促进修复损伤的周围神经[6- 9]。

2对肌源干细胞(MDSC)的认识及研究

MDSC是近年来的研究热点，以往很多文献均是报道有关于肌卫星细胞和成肌细胞的。Asakura等[10]研究发现肌卫星细胞具有自我更新和成肌、成脂肪、成骨等多向分化的能力，故有“肌肉干细胞”之称，但其是一种向成肌系细胞定向分化的前体细胞。有文献[11]报道MDSC是与肌卫星细胞完全不同的一群细胞群,可能是一群原始的干细胞，且未向任何方向分化。研究证实，MDSCs可大量扩增复制，其在体外传30代后仍可保持其原有的表型特征；在体外进行300次扩增后仍未出现自我复制衰老的征象，依然可以维持较高水平的Sca- 1和CD34表达，但MDSCs的扩增潜能并非是无限的[12]。另外，MDSCs在一般情况下，无诱导因素的作用时，其可定向分化为肌细胞；在特殊的诱导因素刺激下，MDSCs可以分化为心肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、软骨细胞和神经细胞等[13]。Bedair等[14]以小鼠为实验对象，通过小鼠骨骼肌损伤模型研究证实，MDSCs同时促进受损肌肉及其周围血管、神经的再生，他们也进一步发现在再生肌组织和体内CD133+/CD34+MDSCs的迁移能力要比SCs更为突出。此外，研究者还发现MDSC缺乏Ⅰ型主要组织相容性复合体(MHC- Ⅰ)，由于MHC- Ⅰ是导致移植组织的排斥反应的重要因素之一，故MDSC具有免疫赦免特性、抗原性极低等特点。正是由于MDSC的这一特性使其异体甚至异种移植成为可能。而作为理想的组织工程种子细胞需要具备的条件有：(1) 可以通过培养扩增等方式大量复制增殖；(2) 具有多向分化的能力，可分化为所需细胞；(3) 具有免疫赦免特性，抗原性低等。由此可见，MDSC完全具备作为理想种子细胞的条件[15- 16]。因此，目前MDSC已被广泛研究应用于治疗压力性尿失禁、心脏疾病、肌肉障碍疾病、神经损伤等疾病[17- 20]。

3MDSC治疗周围神经损伤的基础实验方法

3.1MDSC的分离纯化、培养及鉴定

取新生小鼠获取其纯净的骨骼肌组织，剪碎，应用酶消化法对肌组织进行消化并离心、过滤提取细胞液，然后经改良pre- plating差速贴壁法等方法分离、纯化，最后获得小鼠的原代MDSC，并用台盼蓝染色等方法检测所提取纯化的MDSC的活性，应用倒置相差显微镜观察细胞形态改变和生长状态，定时更换新鲜培养液[21- 22]；MDSC的鉴定常采用检测其表面标志物的方法。而MDSC几乎没有特异性表面标志物，国内外大部分实验室联合检测Desmin(肌源性标志物)及 Sca- 1(干细胞标志物)对其进行鉴定。Sca- 1是迄今为止研究者们公认的MDSC的表面标志物[23]。Qu- Petersen等[11]研究发现90%的MDSCs表达Sca- 1。另据报道，在MDSCs中Desmin阳性率达90%；而在平滑肌细胞及成纤维细胞中Desmin的阳性率仅15%[24]。有文献[24]称，MDSC表面还表达CD13、CD10、CD56等，但其不表达造血细胞表面标志物CD45。

3.2MDSC向SCs诱导及鉴定

取原代提取的MDSC进行铺板，待其贴壁后更换混有诱导液的培养液，并定期换液，严密观察。细胞有形态学上的变化时，则立即通过多种实验鉴定技术，如免疫荧光、流式细胞术等对其进行鉴定。目前绝大多数实验室通过检测SCs特异性标志物S- 100、GFAP和p75以确定SCs的表型[25- 27]。其中，S100蛋白仅在神经系统胶质细胞高度特异性地表达，主要包括星形胶质细胞(CNS内)和SCs(PNS内)[28]。GFAP是一种分子量为50~52KDa的酸性胶质蛋白，是胶质细胞的标志物之一，当胶质细胞受到各种代谢、物理刺激时其表达增强[29]。p75是神经营养因子的低亲和力受体，广泛分布于神经系统及肿瘤细胞中[30]。

3.3制造鼠周围神经损伤模型并移植类SCs

选取数只成年健康裸鼠麻醉后暴露一侧坐骨神经，做轴突切断术，切除一定距离的轴突造成神经缺损，并向缺损处注入类SCs，再应用显微外科缝合线缝合神经外膜。动物清醒后放回动物室单独饲养。

3.4实验结果检测

通过多种直接或间接的实验检测技术对术后鼠周围神经损伤恢复情况进行检测，并应用统计学软件对检测结果进行统计学分析。目前主要的检测技术有：(1) 步态分析：从行为学角度观察大鼠触地/抬起、步长、步频、速度等，鉴定神经对靶器官的控制能力。(2) 电生理：通过肌电图、神经电图、诱发电位观察周围神经电恢复情况。(3) 荧光显微镜下观察：Dil标记的MDSCs分布、生长情况。(4) 免疫组织化学：检测神经特异性蛋白，如S100、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)、M2/M6的表达。(5) 大体及组织学检测：通过HE染色观察再生神经组织细胞形态。(6) 荧光镜逆行示踪：观察新生神经轴浆流运输能力等[31]。

4MDSC治疗周围神经损伤的新研究突破

目前国外内对MDSC诱导分化治疗周围神经损伤尚处于动物实验的基础研究阶段。最近，国内研究者唐乙等[32]用ELISA等化学方法对小鼠SCs条件培养液进行成分检测分析，发现小鼠SCs条件培养液中除成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基本检测不到外，神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经营养素- 3(NT- 3)、血小板源性生长因(PDGF)、胰岛素样生长因子- 2(IGF- 2)均有不同量的表达。于是他们用以上5种因子单一、两两组合、三三组合分别对小鼠的MDSC进行诱导。结果NT- 3、PDGF、IGF- 2组成功诱导其分化为类SCs，并表达了SCs的特征性标志物Sl00、GFAP和p75。在国外，研究者将由人类的骨骼肌提取的MDSC移植到成年裸鼠的坐骨神经缺损处，数周后裸鼠原本丧失运动功能的后肢明显得到恢复，他们手术暴露原来植入人MDSC的坐骨神经缺损处，发现原来缺损处有了明显的组织学恢复，而且缺损处再生的神经经鉴定有明显的朗飞结等结构再生，而且其包含的神经纤维数量与正常的神经基本一致，并且该裸鼠患肢受坐骨神经支配的腓肠肌也没有出现萎缩[31]。

5结语

尽管目前已有方法成功将MDSC定向诱导分化为类SCs，并且运用人MDSC修复裸鼠的坐骨神经缺损也大获成功。但如何科学地将类SCs移入具有正常免疫功能的动物活体内促进神经缺损修复，以及如何将来自动物实验的结果应用到临床等等还有一系列难题均是国内外研究者还未曾涉猎的，可谓目前的MDSC治疗周围神经损伤的实验研究突破仅仅为万里长征刚走完一步，此后还有大量的难题等待着我们科研工作者去竭力探索。但MDSC仍是目前治疗周围神经损伤最有前景的组织工程学材料。相信随着干细胞生物工程的飞速发展，MDSC应用于临床治疗周围神经损伤的日子必然为期不远。

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doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．033

[中图分类号]R745

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)01- 0143- 04

[通信作者]刘建宇E- mail:liujianyu6@hotmail.com

[作者简介]刘志鑫(1988-)，男，陕西安康人，在读硕士研究生。E- mail:1025262831@qq.com

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81272015)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 09- 18

[引文格式] 刘志鑫，张洪雨，刘建宇.肌源干细胞治疗周围神经损伤的研究进展[J].东南大学学报:医学版，2016，35(1)：143- 146.

·综述·