基于小叶嫁接法的草莓病毒症状鉴定

韩荣华

摘 要：为了分析几种主要病毒病在指示植物上的症状，利用指示植物UC10、UC5通过草莓小叶嫁接法，检测草莓病毒症状，特别是单一病毒感染指示植物时的症状。通过设置多重处理、对照，比较各处理间、处理内症状差异，得出病毒在各种指示植物上的症状特点。检测结果表明：首先，此次试验所检测的病毒为我国主要草莓病毒，它们是草莓轻型黄边病毒、草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒；其次，在嫁接前准备方面总结出一套培育壮苗的方法，可显著提高叶柄粗度34.76%，提高叶柄长度47.83%，为提高嫁接成活率提供了很大的帮助；再次，在嫁接过程中应用科学高效的嫁接方法，达到了嫁接成活率100%，为后面的症状鉴定提供了便利；最后，根据观察的症状，推测草莓轻型黄边病毒与草莓镶脉病毒之间的相互影响关系。

关键词：草莓；病毒；小叶嫁接；指示植物

我国草莓产区普遍存在的病毒有4种，即草莓斑驳病毒（SMoV）、草莓皱缩病毒（SCrV）、草莓轻型黄边病毒（SMYEV）和草莓镶脉病毒（SVBV）。 草莓感染病毒后，特别是感染单种病毒，大多症状不显著或难以看出什么症状，称为隐症。 草莓病毒侵染草莓后，主要表现为叶片失绿、畸形、生长量减少、植株矮化、产量下降、品质变劣等。目前，我国草莓产区中这4种病毒的总侵染株率达80.2%，其中单种病毒侵染株率为41.6%，两种或两种以上病毒复合侵染株率为38.6%。单—病毒感染植株可使草莓减产20%～30%，两种病毒复合感染减产可达50%，栽培年限越长，感染的病毒种类越多，发病受害程度越重。

目前对草莓病毒的检测主要有4条途径，即对栽培植株的外观性状直接观察分析判断；利用电子显微镜直接观测植株组织中的病毒；利用医学上抗血清鉴定法检测草莓病毒；在特定的指示植株上接种鉴定。由于病毒侵染栽培植株表现的症状在不同的生育阶段和季节中不甚一致、明显，用直接观察的办法难以明确判定侵染病毒的种类，电子显微镜法和抗血清检测法操作复杂、要求精密、适用面太窄，而指示植物接种检测法简单直接又方便实用。

自从哈雷斯（1942）提出林丛草莓（Fragaria Vesca）可以作为草莓病毒检测指示植物以来，已确定林丛草莓中的UC4、UC5、UC6以及深红草莓（Fragaria Virginiana）中的UC10、UC11和UC12共6个单系作为草莓主要病毒检测的指示植物，并在国际上通用。为了提高检测的准确性，有时又在草莓病毒检测指示植物中接种了特定的潜隐型病毒，使有的病毒病症状易于显现。较常用的是Frazier（1974）改进的小叶嫁接法，检测并保存病毒。

本试验通过小叶嫁接法鉴定分析几种主要病毒病在指示植物上的症状。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所需材料有指示植物UC10、UC5，生产用的已染病毒草莓苗，以及嫁接用的刀片、70%浓度乙醇、捆绑用塑料条（厚0.08毫米，宽9毫米，长20厘米）、塑料袋（膜）、游标卡尺、数码相机等。因组织培养的UC5茎尖取样不同，株系间有差异，所以UC5分成3个株系，用UC5（1）、UC5（2）、UC5（3）表示。

1.2 嫁接方法

所有嫁接试验均采用劈接法，具体步骤如下。

1.2.1 准备嫁接材料 选择嫁接用的接穗与指示植物。准备好嫁接刀片、捆绑用的塑料条。接穗与指示植物尽量粗大，便于操作，其次注意叶龄，指示植物叶龄以叶片充分展开的新功能叶为宜，因为要保证它在嫁接后可生长期足够长，便于满足观察与鉴定的需要。而相对于接穗的叶龄，最好与指示植物叶龄相匹配。如果条件有限，至少选择在20天内不会自然衰亡的叶片。然后留叶柄3厘米以上采摘接穗，准备嫁接。

1.2.2 切叶 用刀片沿指示植物中间叶片根部两侧斜向内切，两刀汇于一点，刀口呈“V”字型，刀深小于1毫米，取下中间叶片。然后切接穗，在接穗中间复叶根部沿斜向外方向削去两侧叶片，刀深至少1毫米。然后再沿两侧切口向下削成契型。两面尽量作到一刀成型、削面平滑。楔型面长在0.8～1.5厘米范围内，过短影响嫁接成活率；过长捆绑费时，影响工作效率，1.2厘米为最适长度。再于指示植物“V”型切口底端处，向下切至与接穗等长深度，使指示植物切口上端与接穗切口上端相平，或略大于。

1.2.3 捆绑 以事先准备好的塑料条，从下端开始自下而上捆绑。要求每绑一圈前都加力使塑料条拉伸变长，然后再绕圈，随着捆绑圈数的增加，可以借助塑料条回缩力量使伤口接合处紧密贴合，有利于成活。绑到上端切口时，注意绑紧，使切口不直接暴露于空气中，防止失水。然后向下回绑至底端，在底端打结。最后可以不必涂抹凡士林油，即达到保湿效果，因为紧绑的塑料条层层紧贴，完全可以防止透气、失水，而且节省材料和时间，提高工作效率。

1.2.4 套袋保湿 嫁接完毕的指示植物应套透明塑料袋保湿。塑料袋高度应高于指示植物5～10厘米，以不限制植株生长为宜。在袋的中下部留有一透气孔。浇足水后，置于温度1～20℃环境中，完全避免太阳直射光。湿度以肉眼观察：叶片早上结露，中午叶片干燥，袋内壁始终有小水珠为宜。10～14天后揭袋，最少不得低于7天。

2 病毒症状鉴定

2.1 草莓轻型黄边病毒症状鉴定

在植株上采摘4枚叶片，分别嫁接到指示植物UC10，UC5（1），UC5（2），UC5（3）上，成为一个处理。记录分析处理内各指示植物发病症状，发病时间，及同一指示植物在各处理间的发病症状和发病时间。

草莓轻型黄边病毒只发生在成熟功能叶片前端或叶缘，表现为片状暗红色斑。依植物抗性不同及感染轻重不同，有复叶中的单个叶片发病和多叶同时发病多种情况。中期红斑处颜色变褐，叶片病变处变薄，叶绿体彻底死亡，叶片无法光合作用，最终导致整个叶片提早死亡。

通过处理内比较，草莓轻型黄边病毒在各指示植物上症状相似，无明显差异。处理比较则UC10，易表现症状，且潜伏期短，发病较快。上草莓轻型黄边病毒较适宜的指示植物。由于株系间差异UC5（2）次之，UC5（1）再次之，UC5（3）无发病症状。

分析原因：可能是由于株系间脱毒有差异，所携带的潜隐病毒不同，造成最终同种异株系间表现有差异。

2.2 草莓班驳病毒症状鉴定

发病植株中，幼嫩叶片感病症状明显。前期叶片普遍褪绿；中期生长势衰退；后期叶片硬质化，并严重黄化。三重复叶已展开的嫩叶发病后，中间叶片靠近叶柄处的叶缘明显向下反卷，两侧复叶也有不同程度下卷。幼叶叶背靠近叶柄处有硬质黄化斑块。叶片未展开的幼叶，叶片扭曲，黄化。叶背及叶柄茸毛多而密，不久便枯黄失去生活力。成熟叶片感病后，叶片变薄，失去肉质感，次脉间叶肉凹凸不平，呈波浪状起伏，造成叶片不同程度扭曲畸形。据症状观察和数据分析UC5（2）症状表现较明显，属于易感株系，做指示植物效果较好。

2.3 草莓镶脉病毒症状鉴定

症状1：观察本组指示植物，发病症状较统一。草莓镶脉病毒在指示植物上表现症状是：感病指示植物前期大部分叶片均匀褪绿，后期，叶片正面主脉两侧出现不规则嫩黄色斑，叶片背部相应部位呈暗黄色、硬化。幼龄叶片症状尤其明显，幼叶叶片较小，叶柄较短，叶背、叶柄茸毛较多、较密，叶片变硬质、脆化。整株表现矮化特征，抽生新芽较少，植株生长势减缓。

综合试验过程中各组发病症状分析：发病的各处理内症状相似。有一处理内各指示植物均未发病。推测原因由于接穗株所携带病原数量差异导致指示植物未发病。根据发病株发病情况统计得出各指示植物对草莓镶脉病毒的敏感度由高至低顺序为、UC5（1）、UC10、UC5（2）、UC5（3）。

症状2：症状相似第一组轻型黄边病毒的症状，此症状表现比例也较大，但多数不明显。结果分析：由于已知接穗带有草莓镶脉病毒，对于是否带有草莓轻型黄边病毒及其他病毒不确定，但最终又表现出草莓轻型黄边病毒的典型症状，所以可以推论出两种情况。推论1：接穗中普遍含有草莓轻型黄边病毒。但从发病症状来看，症状均较轻微，不明显。所以推测，草莓轻型黄边病毒与草莓镶脉病毒同时存在时，镶脉病毒会干扰轻型黄边病毒的发病，使之发病减弱，可以称这种现象为“拮抗效应”。推论2：接穗中并不携带轻型黄边病毒，指示植物中含有可被激活的隐性病毒。接穗中的镶脉病毒与指示植物接合，促进了指示植物体内相应隐性病毒发病，使之处于激活态，从而表现出非接种病毒症状，可以称这种现象为“活化效应”。

据症状观察和数据分析UC5（2）症状表现较明显，属于易感株系，做指示植物较好，UC10次之。

3 结论

在嫁接部分，作者总结出一套嫁接流程和两种育壮苗方法，依此方法操作，在试验中嫁接成活率可以达到100%。

在病毒症状鉴定、分离过程中，通过观察嫁接之后的指示植物表现，统计并分离出草莓轻型黄边病毒、草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒在指示植物上的发病症状。有相同点也有异同点，三种病毒症状相同点：叶片都有褪绿表现，指示植物长势有不同程度衰退。有的病毒症状间区别不大，但通过较仔细的观察比较，可以发现它们之间不同之处。草莓轻型黄边病毒症状是：成熟叶片叶缘有黄斑表现；草莓斑驳病毒症状是：叶片叶肉有凹凸变化，造成叶片畸形，成熟叶片比幼嫩叶片畸形明显。草莓镶脉病毒症状是：叶片主脉两侧叶肉呈带状黄化，叶片无畸形表现。但是，在实际生产中乃至试验中常常会遇到某些植株有复合侵染现象，即表现出两种及两种以上症状。所以给病毒鉴定工作带来诸多干扰与不便。在初步鉴定、分离出病毒症状之后。又用小叶嫁接法对一些生产品种随机检测，发现各病毒在田间感染率及复合感染率都较高，分别占13.3%、36.7%、23.3%、26.7%。

通过草莓小叶嫁接法检测病毒，在本次试验中各病毒检出率普遍在75%以上，检出率较高，所以在生产上可以应用此方法检测病毒。但是，前提条件有二：一是保持较高的嫁接成活率，才会及时可靠的得到检测结果，节省时间，在最短的时间内拿出治疗措施，挽救生产上损失，发挥出小叶嫁接法应有的作用。二是对指示植物的繁殖和保留要保证较高的纯度。本次试验中UC5分为3个株系，即UC5（1）、UC5（2）、UC5（3），在3个株系中UC5（2）表现往往明显于其余两株系，而在检测轻型黄边病毒试验中，UC5（3）株系指示植物中无一株有相应症状表现，同样是采自同一母株的接穗嫁接到UC5（1）、UC5（2）上都有不同程度症状表现。所以，在指示植物繁殖与保留上应作到纯化。

综合比较指示植物UC10、UC5。检测草莓轻型黄边病毒用UC10效果较好；检测草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒用UC5较好。

（责任编辑 亓 国）