甜高粱茎汁及茎渣同步糖化发酵工艺优化

陈朝儒，王　智，马　强，张丽娜，奚亚军※，顿宝庆，李桂英，路　明，杜风光

（1.西北农林科技大学农学院，杨凌 712100；　2.中国农业科学院 作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，北京 100081；　3.车用生物燃料技术国家重点实验室，南阳 473000）



甜高粱茎汁及茎渣同步糖化发酵工艺优化

陈朝儒1,2，王智2，马强1，张丽娜2，奚亚军1※，顿宝庆2，李桂英2，路明2，杜风光3

（1.西北农林科技大学农学院，杨凌 712100；2.中国农业科学院 作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，北京 100081；3.车用生物燃料技术国家重点实验室，南阳 473000）

摘要：为了提高甜高粱秸秆乙醇生产中茎汁和茎渣的利用，以甜高粱茎汁及其渣为发酵原料，对茎汁茎渣混合原料同步糖化乙醇发酵的工艺条件进行优化研究。采用Plackett-Burman（PB）筛选设计试验筛选出影响甜高粱茎秆渣汁同步糖化乙醇发酵的显著因素。采用响应面法建立了同步糖化发酵乙醇生产的乙醇产量数学模型。根据该模型进行了工艺参数的优化，以乙醇产量为指标，试验所得甜高粱茎秆渣汁同步糖化化乙醇发酵的优化工艺条件为：发酵温度36.58℃，混合纤维素酶添加量=23.5 (FBU/mL)/35.25 (CBU/mL)，甜高粱渣汁质量体积比为8.2%，理论预测乙醇产量为89.2%，在此条件下进行验证试验，乙醇产量为88.98%，平均质量浓度，验证了数学模型的有效性，为提高甜高粱茎汁及茎渣混合原料同步糖化发酵产乙醇和提高发酵效率提供参考。

关键词：发酵；乙醇；优化；甜高粱茎汁；甜高粱茎渣：同步糖化发酵；响应面分析法

陈朝儒，王智，马强，张丽娜，奚亚军，顿宝庆，李桂英，路明，杜风光. 甜高粱茎汁及茎渣同步糖化发酵工艺优化[J]. 农业工程学报，2016，32（3）：253－258.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.03.037http://www.tcsae.org Chen Chaoru, Wang Zhi, Ma Qiang, Zhang Lina, Xi Yajun, Dun Baoqing, Li Guiying, Lu Ming, Du Fengguang. Optimization of ethanol production from bagasse and juice of sweet sorghum stem by simultaneous saccharification and fermentation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(3): 253－258. (in Chinese with English abstract)doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.03.037http://www.tcsae.org

0　引　言

随着化石日趋短缺，能源需求是二十一世纪面临最大的挑战之一[1]，这也同时促进了生物能源替代石油的研究和应用。传统的乙醇生产工业发酵原料多为粮食或陈化粮。甜高粱[Sorghum bicolor (L). Moench]是一种非常有发展前景的非粮能源作物[2]，亩产4～5 t高糖分和纤维的秸秆[3]。而甜高粱茎汁所含糖分以及茎渣经处理后也可以进行乙醇发酵[4-5]，这样不仅会提高甜高粱的综合利用，还降低种植及生产成本[6-7]。

甜高粱作为一种重要的生物质能源植物，因为其茎秆富含非结构性碳水化合物（蔗糖、葡萄糖及果糖）和结构性碳水化合物（纤维素和半纤维素）[8]。甜高粱茎秆里的这些糖分比较容易乙醇发酵，通常采用液体发酵[9-10]和固态发酵[11-12]技术生产乙醇，而茎渣里含有与糖分大致相当的木质纤维素成分[13]。将这些茎渣也同时用于乙醇发酵是一个难点。而每公顷甜高粱经过发酵可生产无水乙醇5 800～6 500 L，比单位面积甘蔗生产的无水乙醇量高出20%～30%，对于保证粮食安全和制取燃料乙醇等方面都具有非常广阔的发展前景[14-15]。

同步糖化发酵技术（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）是纤维素乙醇发酵工程领域的重要内容之一。SSF有利于水解产物及时被发酵微生物代谢为乙醇，消除糖对纤维素酶的抑制作用，它克服分步糖化过程中水解率低、设备利用率低以及发酵周期长等缺点[16]。据报道，成本可降低20%以上[17-18]。最重要的是这种工艺可提高乙醇产量，通常可比分步糖化发酵增加40%[19]。SSF有很好的应用价值。

响应面法（response surface methodology，RSM）[20]已广泛应用于生物酶生产、乙醇发酵的工艺优化[21-23]。目前，对甜高粱茎秆榨汁或渣分别进行乙醇发酵的响应面优化研究较多[24-26]，而且对茎渣都进行会造成环境污染和成本增加酸、碱或气爆等预处理后再进行SSF发酵，但以甜高粱茎汁及粉碎的茎渣为原料，利用代谢木糖的重组酿酒酵母进行同步糖化发酵生产乙醇的优化工艺未见报道，代谢木糖的重组工业酿酒酵母能够利用茎渣糖化第二大产物木糖发酵乙醇。为此，本研究以甜高粱茎汁和茎渣为原料，探索SSF发酵的可行性及最佳渣汁比例。以发酵温度、纤维素酶添加量及甜高粱茎渣汁比为自变量，以甜高粱茎渣汁混合物同步糖化乙醇发酵过程中乙醇产量为响应值，利用Box-Behnken试验设计，考察自变量与因变量之间的关系，并优化甜高粱茎汁茎渣混合SSF生产乙醇的工艺，为甜高粱茎秆生产燃料乙醇的提供新的工艺模式以及为甜高粱茎秆综合利用的提供产业化模式。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1原料

甜高粱茎汁及茎渣：甜高茎秆于2012年10月17日采自于中国农业科学院作物科学研究所北京昌平实验站，品种为M81E。茎秆于当日在该试验站经SX300型榨汁机榨汁后，甜高粱茎秆榨取汁液经高温高压灭菌之后，4℃保存。测定茎秆汁液中的主要成分，茎渣用蒸馏水冲洗至中性，烘干干燥后粉碎至40目备用，甜高粱茎汁及茎渣基本成分测定结果见表1。

表1　甜高粱茎汁及茎渣成分Table1　Components of sweet sorghum juice

1.1.2糖化酶、菌种

纤维素酶：Novozymes NS 50013（酶活为70 FPU/mL）混合纤维素酶和Novozymes NS 50010 β-葡萄糖苷酶(酶活为250 CBU/mL)（北京诺维信（中国）有限公司）。

发酵菌种：实验室构建的木糖代谢重组酿酒酵母RXI-T1308-U（尿嘧啶营养缺陷型），该菌株是以耐较高温度及来高糖发酵的工业酿酒酵母T1308为出发菌株，通过基因同源重组构建的能够代谢木糖发酵乙醇的工程菌。

1.1.3酵母培养基

种子培养基：酵母培养基YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，固体平板添加2%琼脂）。

发酵培养基：甜高粱渣、茎秆汁液、(NH4)2SO45 g/L、KH2PO32 g/L、MgSO41 g/L、酵母提取物5 g/L。

1.2试验仪器

粗纤维测定仪（FIWE 6型，意大利VELP公司），恒温摇床（Escotron S-000114311型，瑞士伊孚森公司）；高压灭菌锅（MLS-3780型，日本三洋电机公司）；超净工作台（LAZ-4A1型，新加坡艺思高科技有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9070A型，上海一恒科技有限公司）；高速万能粉碎机（FW80型，天津市泰斯特仪器有限公司）；立式压榨机（SX300型，广东佛山利宝达有限公司）；分析天平（AL204型，瑞士梅斯特-托利多集团）；高效液相色谱仪（Waters 2695型，北京科益恒达科技有限公司）。

1.3试验方法

1.3.1茎渣及茎汁成分测定

甜高粱渣木质纤维素组分测定：范氏纤维素测定法。

甜高粱茎汁及发酵醪液中糖分测定：高效液相色谱法（HPLC），高效液相色谱仪WatersHPLCe2695，色谱柱Waters Sugar Park I（300 mm×6.5 mm）（Bio-Rad，USA），采用折光示差检测器（Waters 2414）检测。进样量20 μL，柱温80℃，流动相50 μg/L EDTA CaNa2，洗脱流速0.5 mL/min

1.3.2SSF流程

将60 mL灭菌后甜高粱汁液置于150 mL三角瓶中，于200 r/min条件下在恒温摇床培养箱中连续发酵。

1.3.3乙醇浓度测定

取60 h发酵液，以HPLC测定发酵液乙醇浓度（见1.3.1节）。

1.4试验设计

1.4.1PB试验设计筛选影响乙醇产量的显著因素

PB试验设计：选择影响甜高粱茎秆渣汁混合同步糖化发酵的8个因素（发酵温度、糖化酶添加量、酵母接种量、pH值、甜高粱茎秆渣汁比、发酵时间、硫酸铵用量、尿嘧啶用量）作为变量，因为发酵菌株为尿嘧啶营养缺陷型，所以选择尿嘧啶作为其中1个因素，其余因素是常见影响乙醇SSF的因素。增添3个虚拟变量，变量均取2水平，总变量为11个，响应值为乙醇产量（Y）。

1.4.2最陡爬坡试验设计

根据PB试验确定的显著因素，设计最陡爬坡试验，其余非显著性因素保持原来的中心点水平，同时逐渐提高3个显著因素实际水平，来分析它们对乙醇产量的影响（见表2）。

表2　爬坡试验设计及试验结果Table 2　Results and design of path of steepest ascent experiment

1.4.3响应面法（response surface methodology）混合发酵优化试验设计

根据最陡爬坡试验确定出响应面中心点及各个显著因素的变化步长。根据Box-Behnken 中心组合设计原理设计了以温度X1、酶添加量X2、渣汁比X5为自变量，每个因素取3个水平，以（−1，0，1）编码试验。响应面分析方法试验因素编码和水平见表3。对发酵温度、酶添加量和渣汁比进行3因素3水平共17个点的响应面分析试验。

表3　Box-Behnken试验因素与水平表Table 3　Factors and levels of Box-Behnken test

1.4.4优化结果验证试验

根据响应面优化获得的最佳参数条件进行验证试验，以验证优化结果的准确性，本试验只有一组处理，做3个重复试验。

1.4.5数据处理及分析

所得数据用软件Design Expert 8.0分析（P=0.05）。

2　结果与分析

2.1影响甜高粱茎秆渣汁同步糖化发酵因素的显著性分析

PB设计的试验结果进行的回归分析表明，该PB试验设计模型的决定系数R2为0.9690，校正决定系数Adj.R2为0.8863（表4）。对该PB模型进一步分析，发现发酵温度（X1），酶添加量（X2）及甜高粱渣汁比（X5）对乙醇产量的影响最为显著（P＜0.05），表明这3个因素为能有效提高乙醇产量。而其余因素无显著影响，因此选择3个显著因素X1、X2及X5进一步进行优化试验。

表4　PB设计回归分析Table 4　Regression analysis of PB design

2.2釆用最陡爬坡试验确定显著因素的优化区域

对PB设计回归分析确定的3个显著因素（X1、X2、X5），设计最陡爬坡试验，试验设计及结果见表2。乙醇产量随着3个因素的增加或升高表现出先升后降的趋势。发酵的最优条件在试验3的水平上，因此选择该水平为响应面试验中心点，其余非显著性因素保持原来的中心点水平，同时逐渐提高3个显著因素实际水平，来分析它们对乙醇产量的影响，这些因素的步长分别为：3℃、5FPU/5CBU、1.5%。

2.3响应面二次多项回归模型的建立及检验

2.3.1二次项回归方程的模型的建立及检验

对发酵温度、酶添加量和渣汁比进行3因素3水平共17个点的响应面分析试验结果见表5。

表5　Box-Behnken试验设计及结果Table 5　Design and results of Box-Behnken experiment

利用Design Expert 8.05b软件对Box-Behnken中心组合试验结果（表4）进行二次多项回归拟合，获得发酵乙醇产率对温度、纤维素酶添加量及甜高粱渣汁的多元二次回归模型。

回归拟合试验数据，回归方程为：

二次交互项X1X5作用不显著（P=0.2946>0.05），去掉它的方程为：

式中Y为乙醇产量的理论预测值，从回归模型方差分析结果（表6）可以看出，回归模型显著，P值小于0.0001，回归方程的拟合度也非常好，R2=0.9987，这表明预测值和试验值之间的相关性很高；模型P值<0.0001，模型失拟P 值=0.8719，表明该二次响应面回归模型失拟不显著，而回归极显著；由R2=0.9987、Adj. R2=0.9971及CV=0.0099，这些都表明该模型是可靠的，因此该回归模型可用于甜高粱渣汁混合同步糖化发酵乙醇工艺的理论预测。

从模型回归系数显著性检验可以看出，对乙醇产量（Y）影响最大为：X2、X5、、以及X1X2；然后依次为：、X1及X2X5）；X1X5对乙醇产量（Y）的影响不显著（P=0.2946>0.05）。

表6　BB试验设计的回归分析Table 6　Regression analysis of BB design

2.3.2混合发酵工艺参数交互作用的响应面分析

为了直观展现甜高粱茎秆渣汁混合发酵显著因素对发酵终产物乙醇产量的影响，二次三项回归方程做出响应面图（见图1），它们分别直观展示了2个重要显著及其交互作用对产物乙醇产量的影响。

图1　响应曲面分析Fig 1.　Response surface analysis

由发酵温度和酶添加量的交互影响的响应面图可知（图1a），当甜高粱茎秆渣汁比处于中心水平7%时，发酵温度和酶添加量交互作用极显著。在温度为编码值−1～0之间（30～37℃），随着酶添加量的增加，乙醇显著增加；但酶添加量过高会导致酵母生长受底物影响，导致乙醇产量降低。提高发酵温度，降低底物对酵母的抑制作用，乙醇产量增加。发酵温度和酶添加量之间存在协同作用。当发酵温度处于33.5～40.5℃范围，酶添加量处于15FPU/22.5CBU～30FPU/45CBU范围时，乙醇产量可以最大值。

由酶添加量和甜高粱茎秆渣汁比交互作用的响应面图可知（图1b），当发酵温度处于中心水平37℃时，酶添加量与渣汁比交互作用显著，在酶添加量较低水平时，乙醇浓度随着渣汁比提高而增加，在高水平的酶添加量时，乙醇产量随着渣汁比提高而先增加后下降。

2.3.3混合发酵工艺参数的优化验证

对所得回归拟合方程进行求解，可以得出模型的最优值，即最优的发酵工艺条件，即当温度为36.58℃，酶添加量为23.5FBU/35.25CBU，甜高粱渣汁比为8.2%。以最优的发酵工艺条件，60 h发酵，甜高粱渣汁为培养基，测定重组菌株RXI-T1308-U利用甜高粱茎秆渣汁混合物同步糖化发酵乙醇的能力，3次重复，获得的平均平均乙醇产量为88.98%，获得的平均乙醇质量浓度为31.78 g/L，与模型乙醇产量89.20%无显著性差异（P＞0.05）质量浓度31.829 g/L，试验值非常接近理论最大值，说明该模型比较真实地反应出各个筛选因素对乙醇浓度的影响，较好地预测实际同步糖化发酵情况，也证明了响应面优化甜高粱茎秆渣汁混合同步糖化乙醇发酵的的可行性。

3　讨　论

一般对于发酵工艺的优化多采取单因素法，但是这会增加工作量而且试验周期也长，采用2水平的PB设计可以从多因素中快速高效地确定对发酵结果产生显著影响的重要因素，以确定的显著因素进一步进行响应面优化分析，通过分析得到最佳条件。为了充分利用甜高粱茎秆汁液及茎渣来提高发酵产物乙醇的产量，同时不对茎渣以传统的会造成环境污染的酸或碱预处理，以及高成本的汽爆预处理，而直接以粉碎的甜高粱茎秆渣汁为原料，采用同步糖化发酵工艺，利用PB及BB设计和响应面分析对甜高粱渣汁同步糖化发酵工艺进行优化，发现主要影响因素为发酵温度、糖化酶添加量及渣汁比；发酵温度和酶添加量，酶添加量和渣汁比均对乙醇产量有显著的交互作用。

发酵温度对乙醇发酵有显著影响，因为糖化酶的最适温度50～60℃远高于酿酒酵母最佳增殖温度29～32℃，因此在茎渣的糖化和酵母发酵之间需要一个最佳温度能最大限度满足糖化和乙醇发酵的需要。工艺优化所得最佳温度为36.58℃，比普通发酵的温度高。糖化酶添加量控制着甜高粱茎渣纤维素及半纤维素的酶解过程中葡萄糖及木糖的生成，从而影响乙醇的产量，糖化酶添加量过少会导致乙醇发酵不彻底，添加量过大会造成成本增加[27]。茎渣比也是显著影响乙醇发酵的因素，渣汁比过低就不能充分利用茎秆里的纤维素和半纤维素，渣汁比过高，糖化过程产生抑制物过多，同时也不利于酶和渣的接触而降低酶解的效率。SSF发酵时间过长会增加成本，本研究比最新甜高粱茎渣SSF缩短108 h[28]。

利用响应面优化设计优化了重组酿酒酵母对甜高粱茎秆渣汁混合同步糖化发酵的发酵条件，得到了一个同步糖化发酵条件的优化组合，应用该同步糖化发酵的优化组合条件对渣汁混合物上罐发酵，乙醇产量达到88.98%，接近最新研究报道的89.4%[27]，乙醇质量浓度达到31.79 g/L，这比相同温度条件下，单纯以甜高粱茎汁为原料发酵所得乙醇质量浓度提高了5.45 g/L。

发酵终产物乙醇产量提高的原因归因于甜高粱茎渣糖化提供了可发酵的葡萄糖以及木糖。茎渣之所以能够与茎汁混合进行发酵，一个很重要的原因就是茎渣糖化过程在短时间内能达到大量葡萄糖及木糖等可发酵糖，这有利于酿酒酵母的乙醇发酵；而糖化酶添加则是将茎渣里的纤维素和半纤维素转化为葡萄糖和木糖的保障，最优的发酵温度能将茎渣的糖化和乙醇发酵协调起来。发酵温度、糖化酶添加量及甜高粱茎秆渣汁比3个重要因素被证明有利于终产物乙醇的产量提高，三者的最优组合从而达到生产工艺简化，乙醇产量提高。这为甜高粱等许多作物秸秆的燃料乙醇的生产提供参考，以期提高经济效益。

4　结　论

1）PB试验确定的影响甜高粱秸秆渣汁混合乙醇SSF 的3个显著因素：发酵温度、糖化酶和甜高粱秸秆渣汁比。

2）通过BB试验建立了SSF的乙醇质量浓度与3个显著因素的回归模犁。

3）响应面二次回归方程模型确定并验证了甜高粱秸秆渣汁SSF法生产酒精的最佳工艺参数：温度为36.58℃，酶添加量为23.5 FBU/35.25 CBU，甜高粱渣汁比为8.2%，接种量为0.2%原料，发酵温度为36℃，尿嘧啶质量分数0.1%，(NH4)2SO4质量分数0.5%，pH值5，发酵时问60 h。该条件下验证，乙醇产量达到88.98%，醇质量浓度为31.78 g/L，与模型乙醇产量无显著性差异。

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Optimization of ethanol production from bagasse and juice of sweet sorghum stem by simultaneous saccharification and fermentation

Chen Chaoru1,2, Wang Zhi2, Ma Qiang1, Zhang Lina2, Xi Yajun1※, Dun Baoqing2, Li Guiying2, Lu Ming2, Du Fengguang3
(1. College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement of Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3.State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology, Nanyang 473000, China)

Abstract:Ethanol production from energy crops which are renewable resources has gotten more and more attentions because of the energy crisis and environmental pollution. Sweet sorghum is considered as the most promising energy crop for the production of ethanol. Sweet sorghum stem is usually used to ferment ethanol, one of which is the liquid-state fermentation with the juice of sorghum stem. But a lot of bagasse of sorghum stem is discarded as wastes. The bagasse can be used as the supplemental materials of the fermentation of the juice. So it is absolutely necessary to study on the optimization of ethanol production with the bagasse and juice of the sorghum stem by simultaneous saccharification and fermentation (SSF). The response surface is an effective method to optimize the operating parameters of the SSF for the maximum ethanol yield. In this study, the Plackett-burman design was adopted to select the significant factors from 8 variables which influenced the ethanol yield and its concentration. The results indicated the ethanol yield and concentration were mainly influenced by the fermentation temperature, the amount of cellulase and the ratio of sorghum stem bagasse to its juice (P<0.05). And the other 5 variables which were not significant were remained to be the center level: the pH value was 5.5, the inoculation ratio was 0.2%, the amount of (NH4)2SO4was 5 g/L, the fermentation time was 60 h, and the amount of uracil was 1 g/L. Based on the results of the selection, the steepest ascent experiment was conducted to determine the center point and the step size. The center point of the fermentation temperature was 37℃ and its step size was 3℃. The center point of the amount of cellulase was 20 FBU/30 CBU and its step size was 5 FBU/CBU. The center point of the ratio of bagasse to its juice was 7% and its step size was 1.5%. Then we adopted the Box-Behnken design and response surface analysis method to optimize the levels of these 3 significant factors, and the regression and the optimal levels of these significant factors were as follows: the regression model was very significant (P<0.0001, R2=0.9987, Adj. R2=0.9971 and CV=0.0099), which indicated that the model was reliable, and therefore, the regression model could be used for the theoretical prediction of the SSF for juice and bagasse of sweet sorghum stem; the fermentation temperature was 36.58℃, the amount of cellulase was 23.5 FBU/35.25 CBU, the ratio of bagasse to juice of sorghum stem was 8.2%, the maximum theoretical yield of ethanol predicted was 89.2%, and the ethanol concentration was 31.829 g/L. The interactive effects were analyzed by response surface analysis. The interactive effect of the fermentation temperature and the amount of cellulase was very significant (P<0.0001); the interactive effect of the amount of cellulase and the ratio of bagasse to juice was very significant (P<0.001); the interactive effect of the fermentation temperature and the ratio of bagasse to juice was not significant (P=0.2946). Under the optimal conditions, the model was proved to be valid by the verification test with 3 repeated tests, and the ethanol yield was 88.98% which was very close to the maximum yield (89.2%). The ethanol concentration was 31.78 g/L, which was very close to theoretical prediction value (31.829 g/L). The results of this optimal technology will provide a reference for the ethanol production technology by simultaneous saccharification and fermentation method for sweet sorghum stem.

Keywords:fermentation; ethanol; optimization; sweet sorghum stem juice; sweet sorghum stem bagasse; simultaneous saccharification and fermentation; response surface methodology

通信作者：※奚亚军，男，陕西白水人，教授，博士生导师，主要从事小麦和生物能源植物柳枝稷的基因工程研究。杨凌西北农林科技大学农学院，712100。Email：xiyajun11@126.com

作者简介：陈朝儒，男，陕西城固人，西北农林科技大学，博士生，主要从事作物育种及生物质能源研究。杨凌西北农林科技大学农学院，712100。Email：chenchaoru2009@163.com

基金项目：国家自然科学基金面上项目--生物能源作物柳枝稷人工穗芽形成机制研究（31171607），农业部公益性行业（农业）科研专项（201503135），中国农业科学院科技创新工程。

收稿日期：2015-07-13

修订日期：2015-12-30

中图分类号：S216.2；Q77

文献标志码：A

文章编号：1002-6819(2016)-03-0253-06

doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.03.037