猕猴桃60Co-γ射线辐射诱变植株变异的ISSR分子标记研究

刘平平，叶开玉，龚弘娟，王发明，莫权辉，蒋桥生，李洁维

(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西 桂林 541006)

猕猴桃60Co-γ射线辐射诱变植株变异的ISSR分子标记研究

刘平平，叶开玉，龚弘娟，王发明，莫权辉，蒋桥生，李洁维*

(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西 桂林 541006)

分析不同辐射处理后“长果”猕猴桃(Actinidialongicarpa)样本的变异性，为猕猴桃诱变育种及加快猕猴桃育种进程提供理论基础。采用0 (CK)、40、60、80和100 Gy60Co-γ射线辐射处理“长果”猕猴桃接穗后，用ISSR分子标记技术对5种处理后的55个样品的多态性进行研究。结果表明：从100条寡聚核苷酸引物中筛选出7条引物进行标记，平均每条引物扩增出14.3条带，其中6.7条多态性带，多态性比率为46.85 %；遗传相似系数为0.79～1.00，聚类分析表明，第Ⅴ类为60Gy 6～8号植株，与对照的遗传距离最远，变异程度最大。因此，辐射诱变可导致猕猴桃发生显著的遗传变异，利用ISSR分析方法，可准确测定辐照样本是否为突变体。

“长果”猕猴桃；辐射；诱导；变异；ISSR；突变体

辐射诱变具有可以产生小量突变，在改良品种的同时对原有优异性状的影响较小等优良特性，是离体诱变育种技术常用的方法之一[1]。目前，辐射诱变最常用最普遍的处理方法是以固定的60Co-γ辐射源装置一次急性照射试材[2]。突变育种技术始于20世纪50年代[1，3]，我国果树的辐射育种工作始于20世纪60年代[1-2，4]，目前已在20多种果树上获得应用[5-6]，并取得较大的成就。辐射诱变在猕猴桃育种也有相关报道。胡延吉等[7]用60Co-γ射线处理2个猕猴桃品种幼芽选育出2个各具特色的新品系。

目前，对辐射诱变分子机理的研究主要包括两个方面：一是以个别性状发生变异的突变体为材料，从分子水平和蛋白质水平寻找引发性状变异的基因，例如Mao等[8]和Biswas等[9]分别就2个拟南芥(Arabidopsisthaliana)突变体进行深入研究，发现了导致突变的控制基因；Yan 等[10]研究发现bc7(t)的脆性突变就是由于OsCesA4基因发生了碱基删除造成的。二是利用分子标记和蛋白质电泳分析DNA变异的研究，可快速准确的从DNA水平研究辐射诱变效应，如李娜等[11]对诱变粳稻9522筛选出1株带有白色中脉的隐性单位点突变的Oswm突变体，通过2种分子标记最终将导致突变的基因精细定位在水稻4号染色体约为122 kb基因上；郭建辉[12-13]等，王阳等[14]，贾月慧等[15]和章宁等[16]应用RAPD分子标记，分别对辐照诱变后发生突变的香蕉新株系漳蕉8号，花朵变异的百合(Liliumspp. )，9个亚洲百合(Asiatic lily)‘pollyanna’基因型突变体及蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrid)诱变苗等与原株系对照，发现不同的突变体均发生基因突变；邢莉莉等[17]通过ISSR分子标记技术分析发现“长紫”辐照后代DNA在不同程度上发生了变异，且基本上与花型和花色的变异类型相关。

传统的猕猴桃选育种途径主要有：一是从野生猕猴桃种质中选育，如国内众多猕猴桃品种；二是从实生后代中选育，如新西兰的“海沃德”(Hayward)；三是从杂交后代中选育，如武汉植物所选育的“金艳”(A.chinensis×A.eriantha)。上述3个育种途径中，野生优株选育最快，但难以获得突破性的品种；杂交育种和实生选种虽然可以获得好品种，但育种周期长，单果种子数量多，且雄株比例大，难度比其他果树要大得多。辐射诱变育种是缩短果树育种周期的有效途径之一。“长果”猕猴桃(A.longicarpa)是由广西植物研究所发现的猕猴桃新种，与毛花猕猴桃(A.erianthaBenth.)近缘[18]。具有果皮极易剥离、维生素C含量高、有独特的芳香气味等特点[19]，但果实偏小。为改良该品种的不良性状，叶开玉等[20]用4种剂量的60Co-γ射线辐射处理“长果”猕猴桃的枝条，以筛选适宜辐射剂量。本研究在此基础上对不同辐射处理后的“长果”猕猴桃样本进行ISSR分子标记，分析不同处理、不同个体在分子水平上是否存在差异，旨在为猕猴桃诱变育种提供理论基础，加快猕猴桃育种进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试“长果”猕猴桃接穗，采自于广西植物研究所(桂林市)猕猴桃种质圃，20年生嫁接成年树。于2012年在广西植物研究所猕猴桃试验场开展田间试验，在广西植物研究所分子生物学综合实验室进行分子标记实验。

1.2 试验方法

1.2.1 接穗的采集与处理 于树体休眠期，从长势中庸的一年生结果枝，选择处于休眠状态尚未萌动的中部饱满芽，每根枝条留8～10个侧芽进行剪截。每10条接穗为一捆，用湿毛巾包裹保湿，在低温冷藏保存备用。

1.2.2 辐射处理 接穗在广西南翔环保有限公司60Co-γ射线辐照中心进行辐射处理。设5个60Co-γ射线剂量处理：0(CK)、40、60、80和100 Gy；用20 Gy·min-1的剂量率照射。

1.2.3 辐射处理后的嫁接与嫁接后管理 2012年2月25日，在广西植物研究所实验场地进行露天嫁接，嫁接砧木为一年生美味猕猴桃实生苗。试验苗木采用单因素随机区组排列种植，每个处理设3个重复，每个重复20个接穗，即20株嫁接苗。接穗嫁接萌芽后，及时抹除砧木上原有隐芽萌发后长出的萌蘖，以免与接穗争夺养分，影响接穗萌发生长。加强栽培后水肥管理，保证嫁接苗的正常生长，并对猕猴桃嫁接萌芽率、成活率和形态变异等进行观测。

1.3 DNA的提取及PCR反应条件

1.3.1 猕猴桃总DNA提取与制备 以100 Gy辐射处理的长果猕猴桃嫁接苗成活株数为标准，分别从不同辐射处理的成活嫁接苗中随机选取11株，采集猕猴桃新鲜嫩叶，并对样品编号(编号取辐射处理的剂量数值和处理样品数，如选取40 Gy处理的11个接穗，编号依次为40-1，40-2，40-3…)，嫩叶用于提取DNA。DNA的提取，参照李思光[21]、姚春潮等[22]改良CTAB法，并做了适当改进，具体如下：①在液氮中把10 mg新鲜猕猴桃叶片研磨成粉末，研磨同时加入40 mg(6 %，W/V)PVP干粉；②将研磨好的粉末转入1.5 mL离心管中，加入700 μl预冷的提取介质(0.2 mol·L-1Tris-HCl，pH8.0；50 mmol·L-1EDTA，pH 8.0；0.25 mol·L-1NaCl)和14 μl β-巯基乙醇，充分混匀后在0 ℃放置10 min。③在4 ℃，7000 r·min-1离心10 min，收集沉淀。④在沉淀中加入700 μl 65 ℃保温的2×CTAB(2 % CTAB；100 mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0；80 mmol·L-1EDTA；1.4 mmol·L-1NaCl，1 % β-巯基乙醇)提取液充分混匀，置于65 ℃水浴1 h，期间每隔10 min轻轻颠倒混匀1次。⑤冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，在4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑥吸取上清液转入新的1.5 mL 离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，在4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑦吸取上清液转入新的1.5 mL 离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，在-20 ℃静置2 h后于10 000 r·min-1离心10 min。⑧弃上清液，沉淀用70 %乙醇漂洗2次，晾干后，溶于100 μl TE中，置于-20 ℃下保存备用。

1.3.2 PCR反应条件 引物选用哥伦比亚大学(University of British Columbia，Set No.9，No.801-900)公布的序列，共100条，由上海Sangon公司合成。以“长果”猕猴桃总DNA为模板进行引物筛选，从100条引物中筛选出7条扩增条带好、信号强且反应稳定的引物(表1)，用于“长果”猕猴桃辐射植株ISSR-PCR分析。

PCR反应体系：采用20 μl的体系进行PCR扩增，其中DNA模板约5 ng，引物0.75 μΜ，2×TaqPCR Master Mix 10 μl，加水补足至20 μl。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，51～53 ℃复性退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后72 ℃再延伸10 min。扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统(Gel Doc 2000TM)拍照，保存图像并观察记录。

1.4 统计分析

电泳图谱中一条清晰条带(DNA片段)，代表一个DNA位点。对DNA条带进行统计，按照条带的有或无赋值。在相同迁移位置上有带(显性)记为1，无带(隐性)记为0，依此构成0/1遗传相似矩阵。仅在重复试验中能够稳定出现的DNA条带用于数据分析。得到的二元数据矩阵用NTSYS 2.1软件中SM法计算遗传相似系数，UPGMA法进行聚类分析，构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 不同辐射剂量处理对猕猴桃嫁接萌芽率、成活率和形态变异的影响

接穗嫁接萌芽后，在对接穗的萌芽率、成活率和形态变异等观察中发现对照的萌芽个数和成活植株数均最多，分别为59、57，成活率达95 %；一年生嫁接苗基部直径最大，为0.92 cm；死亡植株数最少，死亡率仅5 %；而100 Gy辐射处理后的猕猴桃萌芽个数和成活植株数最少，分别为17、11，成活率仅18.33 %；一年生嫁接苗基部直径最小，为0.65 cm；死亡植株数最多，死亡率达81.67 %，而形态变异植株比例高达81.81 %(表1)。在100 Gy的辐射剂量范围内，随着辐射剂量的增加，死亡植株数相应增加；而萌芽个数、成活植株数、形态变异植株数和一年生嫁接苗基部直径相应减少，说明辐射处理对“长果”猕猴桃芽的萌发、植株成活率、植株形态变异和一年生嫁接苗基部直径等均有一定的影响。根据成活植株的外观形态变异可为确定“长果”猕猴桃适宜辐射剂量为60～80 Gy。

2.2 猕猴桃辐射诱变嫁接植株ISSR引物筛选与多态性分析

利用优化的反应体系，从100条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、稳定性强的7条引物进行统计分析。用7条引物对55个“长果”猕猴桃总DNA进行PCR扩增，结果如表2所示，共扩增出100个DNA位点，其中约47个为多态性位点，占总位点的46.85 %。其中U820的DNA条带数和多态位点数最多，分别为17和13，其次是U835和U853，DNA条带数均为15，多态位点数分别为9、8，U846和U847的DNA条带数均为14，多态性位点数分别为5、6，U825和U845的DNA条带数偏少，依次为13、12，多态性位点数依次为1、5。不同剂量辐射处理后多态位点数以60 Gy最多，为46，平均多态位点数为6.6，其次为80和40 Gy，多态位点数分别为34和33，平均多态位点数分别为4.9和4.7，100 Gy处理后多态位点数最少，为30，平均多态位点数为4.3。结合形态变异植株数分析发现，多态位点数与形态变异数相关性不大。

从引物U846的部分PCR扩增结果(图1)可以看出，60-7，60-8没有大于1.1 kb的DNA条带，而80-6和80-7有2条，经辐射诱导的“长果”猕猴桃植株ISSR扩增的带纹丰富，ISSR反应扩增的条带分子量一般均为400～1500 bp。

表1 不同辐射剂量处理对猕猴桃嫁接萌芽率、成活率和形态变异的影响

表2 7条ISSR引物序列及扩增结果

Note：Y=(C，T)，R=(A，G).

2.3 聚类分析

利用ISSR-PCR扩增的116条DNA条带建立遗传相似矩阵，按UPGMA方法进行聚类分析，构建55个“长果”猕猴桃辐射样品的聚类图(图2)。在遗传相似系数0.79～1.00的聚类结果显示，7个ISSR引物能将供试的55个样品分开。依据遗传相似性程度，在遗传相似系数为0.83时，可将55个“长果”猕猴桃植株聚为5类。第Ⅰ类中包含未经辐射处理的CK-1～CK-11，40-1～40-11和60-1～60-5共27个样品，40-1～40-3与对照的遗传距离最近，变异程度最小，其次为40-5～40-11和60-1～60-3，60-4和60-5与对照遗传距离最远；第Ⅱ类为100-1～100-11和80-11；第Ⅲ类为80-1～80-10和60-9～60-11；第Ⅳ类为40-4单株；60-6～60-8为第Ⅴ类，与对照的遗传距离最远，变异程度最大。聚类分析结果表明40、60、80和100 Gy辐射处理后遗传结构发生变异的株数分别为1、5、11、11，随着辐射剂量增加，变异植株数也相应增加，这与形态观察结果一致。聚类分析结果与形态观察结果比较显示，100 Gy辐射处理后形态上发生变异株数有9株，而聚类结果显示11株，说明遗传结构发生变异不一定从外观形态上表现出来。

M：100 bp DNA marker；1～5：60-7～60-11；6～14：80-1～80-9图1 引物U846扩增的部分长果猕猴桃ISSR电泳图Fig.1 The ISSR electrophoretic figure of partial primer U846‘Changguo’kiwifruit

3 讨 论

本研究中，在0～100 Gy的辐射剂量内，随着辐射剂量的增加，植株存活逐渐减少，变异程度逐渐增大，萌芽个数、成活植株数和一年生嫁接苗基部直径逐渐减少，这与郭建辉等[12]研究结果一致。Luckey等[23]研究认为，小剂量或适宜剂量辐射对生物体有刺激效应，高剂量射线对植物生长活性酶起抑制作用。80 Gy以上，植株畸形严重，主要表现在枝条分化和叶片的性状上，枝条节间缩短或不分节，叶片表现簇生、失绿发黄、不对称畸形或皱缩畸形、缺刻等症状；这与Luckey等的研究结果基本一致。成活植株的外观形态变异也可为确定猕猴桃适宜辐射剂量提供依据。结果同时认为，“长果”猕猴桃最佳辐射剂量为60～80 Gy；再次验证了叶开玉等[21]前期试验结果，即“长果”猕猴桃半致死剂量为71.7 Gy的结论。可见，60Co-γ射线诱导“长果”猕猴桃发生变异程度具有稳定性。

根据ISSR电泳图谱分析，与对照相比，60Co-γ射线处理使猕猴桃的遗传结构发生变异，主要表现为ISSR扩增差异条带的增加或者减少，可能是基因组中相关位点碱基变化的结果。这也可能是导致植株的形态发生变异的原因。不同引物扩增得到的DNA条带数不同，条带数越多，相应的多态性位点数也越多，且多态性位点多分布在较大或是较少DNA片段，而不同剂量辐射处理中以60 Gy多态性位点数最多，60 Gy以上反而略有降低，而形态变异发现100 Gy处理的变异植株比例最多。结合聚类结果分析，40-4、60-6、60-7、60-8几个单株与对照的遗传距离最远，变异程度最大，说明在变异植株中，这几个单株本身可能特有的突变位点最多，从而也说明了60 Gy多态性位点数较多的原因，而100 Gy处理的变异植株虽然最多，但是多为变异植株共有的。

图右边数字代表不同处理样品编号Number in right figure represented different samples图2 基于ISSR数据绘制的55份供试材料间的聚类分析Fig.2 The clustering analysis of 55 samples according to ISSR data

4 结 论

本研究结果表明，60Co-γ射线诱变可以造成猕猴桃遗传结构发生改变。根据辐射处理后的嫁接苗在形态和生长方面等的表型变化情况，在一定程度上可进行辐射遗传变异的预测和评估。利用ISSR分析方法，可准确测定辐照样本情况，从中选择基因变异且性状良好的突变体作为选育新品种的目标，同时确定适宜的辐射诱变剂量，为辐射诱变育种提供理论基础和技术支持。

[1]王长泉, 刘 峰, 李雅志. 果树诱变育种的研究进展[J]. 核农学报, 2000, 14(1):61-64.

[2]罗志平, 孟兰贞, 张 勇. 园林植物育种中辐射育种的应用研究[J].农业与技术, 2015, 35(6):145-156.

[3]张建鹏, 尚霄丽, 李明泽, 等. 辐射技术在果树育种中的应用[J].落叶果树, 2014, 46(2):19-21.

[4]林存峰, 李 燕. 钴60-γ射线辐射锦丰梨枝条的当代效应初报[J].甘肃农业科技, 2008, (7):13-14.

[5]陈秋芳, 王 敏, 何美美, 等. 果树辐射诱变育种研究进展[J].中国农学通报, 2007, 23(1):240-243.

[6]李 鹏, 李新华, 张 锋, 等. 植物辐射诱变的分子机理研究进展[J].核农学报, 2008, 22(5):626-629.

[7]胡延吉, 梁 红, 刘 文. 猕猴桃辐射诱变育种研究初报[J]. 中国农学通报, 2012, 28(19):146-15.

[8]Mao A J, Wang T, Song Y R. Fine mapping of AST gene in Arabidopsis[J].Acta Botanica Sinica, 2003, 45(1):88-92.

[9]Biswas K K, Ooura C, Higuchi K, et al. Genetic characterization of mutants resistant to the ant iauxinp-chlorophenoxyisobutyric acid reveals that AAR3, a gene encoding aDCN1-like protein, regulates responses to the synthetic auxin 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid in Arabidopsis roots[J]. Plant Physiology, 2007,145:773-785.

[10]Yan C J, Yan S, Zeng X H, et al. Fine mapping and isolation of Bc7(t), allelic to OsCesA4[J].Acta Genetica Sinica, 2007, 34(11):1019-1027.

[11]李 娜, 储黄伟, 文铁桥, 等. 水稻白色中脉Oswm突变体的遗传分析与基因定位[J]. 上海农业学报, 2007, 23(1):1-4.

[12]郭建辉, 黄锡栋. 香蕉离体试管诱变育种的研究Ⅱ.性状变异观察调查[J]. 福建农业学报, 2002, 17(1):38-39.

[13]郭建辉, 沈明山, 蔡恩兴, 等. 香蕉离体试管芽诱变育种的研究Ⅴ.漳蕉8号株系基因组变异检测[J]. 核农学报, 2003, 17(4):255-258.

[14]王 阳, 李邱华, 李松林, 等. 电子束辐照百合鳞茎后对生长发育的影响及RAPD分析[J]. 西北农业学报, 2013, 22(3):140-147.

[15]贾月慧, 张克中, 赵祥云, 等. 辐射亚洲百合‘pollyanna’雄性不育突变体的RAPD分析[J]. 核农学报, 2005, 19(1):29-32.

[16]章 宁, 苏明华, 徐夙侠, 等. 应用RAPD技术辅助蝴蝶兰辐射育种[J]. 亚热带植物科学, 2007, 36(3):19-22.

[17]邢莉莉, 陈发棣, 缪恒彬. 切花菊“长紫”辐照后代减数分裂行为及ISSR遗传变异分析[J]. 核农学报, 2009, 23(4):587-591.

[18]李瑞高, 李洁维, 王新桂, 等. 猕猴桃属植物九个新种[J]. 广西植物, 2003, 23(3):193-202.

[19]李洁维. 猕猴桃新种长果猕猴桃的生物学特性及评价[J]. 中国果树, 2007(1):32-33.

[20]叶开玉, 李洁维, 蒋桥生, 等. 猕猴桃60Co-γ射线辐射诱变育种适宜剂量的研究[J]. 广西植物, 2012, 32(5):694-697.

[21]李思光, 罗玉萍, 陈万秋, 等. 猕猴桃基因组DNA的提取及其RAPD扩增研究[J]. 南昌大学学报, 2001, 25(3):264-268.

[22]姚春潮, 王跃进, 刘旭峰, 等. 猕猴桃雄性基因RAPD 标记S1032-850 的获得及其应用[J]. 农业生物技术学报, 2005, 13(5):557-561.

[23]Luckey T D. Hormesis with Ionizing Radiation[M]. Fiorida:CRC Press, 1980.

(责任编辑 温国泉)

Study on ISSR Molecular Marker of Kiwifruit Mutational Plant Induced by60Co-γ Ray

LIU Ping-ping, YE Kai-yu, GONG Hong-juan, WANG Fa-ming, MO Quan-hui, JIANG Qiao-sheng, LI Jie-wei*

(Guangxi Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Guangxi Guilin 541006, China)

In order to provide theoretical base for kiwifruit mutation breeding and speed up the breeding process， the variability among irradiation-treated kiwifruit ‘Changguo’ samples were analyzed. The branches of kiwifruit ‘Changguo’ from 55 samples were irradiated by60Co-γ ray in 0 (CK), 40, 60, 80 and 100 Gy, respectively. The polymorphism of these 5 treatments were analyzed using ISSR molecular marker technology. The results showed that 7 screened primers were used for marking from 100 oligonucleotide primers. The average amplified fragment was 14.3, and the polymorphic bands number was 6.7. The polymorphic ratio was 46.85 %. Calculated genetic similarity coefficient was from 0.79 to 1.00. Clustering analysis suggested that the Ⅴclass was 6-8 plants of 60Gy, which the genetic distance was the farthest, and the variation was the largest compared with others. Large genetic variation in kiwifruit was induced by irradiation. It is accurate to measure whether irradiation samples are mutants using ISSR for mutant cultivar.

‘Changguo’ kiwifruit; Radiation; Induction; Variation; ISSR; Mutant

1001-4829(2016)10-2457-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.038

2016-05-07

广西自然科学基金面上项目(2011GXSFA018092)；广西科技攻关项目(桂科攻10100006-4A、桂科能14121008-1-14)；国家现代农业产业体系广西创新团队建设专项(nycytxgxcxtd-03-13)；广西植物研究所科学研究基金项目(桂植业12007)

刘平平(1987-)，女，广西全州人，研究实习员，硕士，主要从事植物病理学研究，E-mail：fhlpp001@126.com,*为通讯作者，E-mail：lijw@gxib.cn。

S663.4

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