民猪NUMB基因克隆与组织表达分析

刘　娣，王鑫鑫，别　墅，张冬杰，汪　亮，李　苓，曹　越（.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨　50030；.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨　50086）



民猪NUMB基因克隆与组织表达分析

刘娣1,2，王鑫鑫1，别墅1，张冬杰2，汪亮2，李苓1，曹越1
（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030；2.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨150086）

摘要：研究采用RT-PCR技术结合克隆测序方法，克隆出全长2 004 bp NUMB基因序列，其中包括1 782 bp开放读码框，该基因编码592个氨基酸。利用生物信息学分析软件对该基因氨基酸序列预测与分析发现：NUMB蛋白二级结构中，转角占很大比例，且蛋白亲水性较强，结构功能域分析发现该蛋白多肽链存在一个N端磷酸酪氨酸结构域（PTB），位于第37~162氨基酸之间。基于不同物种NUMB蛋白序列所构建分子进化树表明，猪与牛、骆驼亲缘关系最近，而与斑马鱼最远。在mRNA水平上，NUMB基因肺中表达量最高，大肠中表达量最低。

关键词：民猪；NUMB基因；反转录PCR；克隆；生物信息学

刘娣,王鑫鑫,别墅,等.民猪NUMB基因克隆与组织表达分析[J].东北农业大学学报, 2016, 47(1): 51-57.

Liu Di, Wang Xinxin, Bie Shu, et al. Cloning and tissue expression analysis of Min pig NUMB gene[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 51-57. (in Chinese with English abstract)

细胞命运决定因子NUMB是一种膜相关蛋白，在进化上相对保守。最先在果蝇神经系统中被发现[1]，随后在多个哺乳动物体内发现该基因存在，并称为mNUMB基因[2]。该基因一般具有两个保守结构，一个是磷酸酪氨酸结构（PTB），一个是羧基端结构（PRR），这两个结构可分别与LDAP⁃NY、α衔接蛋白和E3泛素激酶等多种蛋白相互作用，行使不同生物学功能[3]。其在细胞不对称分裂、内吞、生长、粘附、迁移等过程中发挥作用，并通过Notch和P53等信号途径决定细胞命运[4-6]。mNUMB蛋白在不同组织和细胞中均有表达，但其表达形式存在差异，这种差异不仅体现在表达水平不同，也体现在不同转录剪切变异体上。已知在小鼠、人中均发现4种剪切变异体，经序列比对发现，不同剪切变异体间差异主要是由PTB和PRR结构域内发生小片段插入或缺失造成[7]，从而导致蛋白结合位点发生变化，进而使不同变异体行使不同生物学功能[8]。有报道称，NUMB变异体1是一个可用于检测早期食管癌的生物标记基因[9]。Gho等认为在果蝇中NUMB不对称分布机制是保证感觉器官发育过程中各级细胞正确分裂和分化成熟的决定因素，其功能缺失或过表达均使细胞分裂和子细胞分化方向发生转变，最终导致感觉器官发育异常[10]。Zilian等发现NUMB敲除使小鼠后脑神经元分化推迟，而在前脑没有出现神经元早期分化[11]，因此NUMB具有促进神经元分化作用，NUMB基因缺失导致小鼠胚胎发生严重血管生成重建和神经管闭合障碍，及某些神经细胞系缺失，造成胚胎早期死亡。

本试验前期研究中发现，民猪肌肉组织在受到冷刺激后，NUMB基因转录水平发生显著下降[12]，基于该基因在其他物种中已知的生物学功能，将其作为一个研究民猪耐寒特性的候选基因开展系列遗传学研究，为今后相关研究提供理论基础。

1　材料与方法

1.1试验材料与样品采集

75日龄民猪3头，取自黑龙江省农业科学院畜牧研究所创新示范基地，屠宰后取大肠、背肌、肺、脂肪、心脏、脾、肝脏和腿肌组织块，放于液氮中于黑龙江省农业科学院畜牧研究所综合实验室，-80℃保存。

1.2总RNA提取及反转录

严格按照TRLzol试剂盒（购自Invitrogen）操作手册分别提取各组织样总RNA，用分光光度计检测其260和280 nm处光吸收值，计算浓度和质量，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，-80℃保存备用。取1 μg总RNA使用Prime⁃Script®RT试剂盒合成cDNA第一条链。

1.3 NUMB基因克隆测序

以民猪肝脏cDNA为模板，根据芯片结果所提供EST序列，在NCBI数据库中利用BLASTN程序开展序列同源性比对，寻找其他物种已有NUMB基因序列。在保守区设计1对引物C1和C2（见表1），采用降落PCR方法扩增该基因完整CDS区，PCR反应体系为25 μL，其中10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 2.0 μL，C1（10 pmol·μL-1）1.0 μL，C2（10 pmol·μL1）1.0 μL，rTaq 0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。反应条件为94℃10 min，94℃30 s，64℃30 s，-1℃/cycle，72℃2 min，go to 2，16 cycles，94℃30 s，48℃30 s，72℃2 min，go to 6，15 cycles，72℃10 min。将扩增出片段首先与DL2000 Marker比对，初步判断其大小，进而通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接Pmd18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆菌落，摇菌、提取质粒后，XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定无误后，将质粒送交北京华大公司测序。

表1引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

1.4 NUMB基因序列分析

利用DNAStar软件包中的EditSeq软件对所获NUMB基因核苷酸序列进行5'-UTR、完整编码区和3'-UTR划分；利用Protean软件预测NUMB基因氨基酸序列，并模拟其二级结构。利用蛋白质功能位点数据库PROSITE（http:// www. expasy. org/ prosite）预测民猪NUMB蛋白结构功能域。

1.5构建分子进化树

使用BLASTp程序在NCBI数据库中搜索与民猪NUMB基因同源的其他物种NUMB基因氨基酸序列（Blastp, TBlastX, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST），将所获不同物种的NUMB氨基酸序列使用ClustalX1.83进行序列比对，将比对结果导入MEGA6.0软件，采用Neighbor-Joining算法构建分子进化树，Bootstrap设为1 000。

1.6实时定量PCR鉴定NUMB基因不同组织转录水平

针对NUMB基因设计2条引物C3和C4，选择GAPDH基因作为看家基因，设计引物C5和C6（见表1），分别以各组织cDNA为模板PCR扩增，25 μL反应体系中包含以下成分：SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，C3（10 μmol·L-1）0.5 μL，C4 （10 μmol·L-1）0.5 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）×3 0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 9.0 μL。反应条件如下：95℃10 s，95℃5 s，60℃20 s，go to 2，40 cycles，最后采用2-ΔΔCt法计算各组织间NUMB基因相对转录水平。

2结果与分析

2.1核酸和氨基酸序列分析结果

RT-PCR扩增产物长2 004 bp，包括NUMB基因一个完整的开放读码框1 782 bp，5'-UTR区100 bp和3'-UTR区121 bp（见图1A），编码592个氨基酸（见图1B），多肽链含68个强碱性氨基酸残基，60个强酸性氨基酸残基，183个疏水性氨基酸残基和168个极性氨基酸残基，分子质量为64.51 ku，等电点为8.56。

图1民猪NUMB基因核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)Fig. 1 Nucleotide(A) and inferred amino acid(B) sequences of Min pig NUMB gene

2.2 NUMB蛋白二级结构及保守结构域分析

利用Lasergene的protean软件分析NUMB蛋白质二级结构（Alpha螺旋、Beta折叠、Turn转角、Coil卷曲）、疏水性和表面抗原分布情况，结果如图2所示。可看出该蛋白亲水性较强、抗原结合区较多，其中二级结构中螺旋（Helix）、折叠（Strand）、转角（Loop）所占比例依次为：Helix= 6.9%、Strand=9.4%、Loop=83.6%，转角所占比例最大。

利用蛋白质功能位点数据库PROSITE分析民猪NUMB蛋白氨基酸序列结构功能域，发现该蛋白多肽链存在一个N端磷酸酪氨酸结构域（PTB），位于第37~162氨基酸之间。PTB结构域有1个pH-like折叠结构，能识别磷酸化酪氨酸残基。而与此相对应的SH2结构域，能识别磷酸和邻近羧基端残基，PTB结构域能特异性识别氨基酸末端并使其磷酸化。

2.3分子进化树构建结果

通过对32个不同物种NUMB氨基酸序列比对发现，民猪NUMB基因与其他物种间具有很高同源性，如与牛、山羊、骆驼、兔子、人、鼠同源性分别为96.12%、94.04%、96.46%、85.45%、95.95%、94.10%（见表2）。所构建分子进化树如图3所示。

图2民猪NUMB蛋白二级结构分析Fig. 2 Secondary structure of Min pig NUMB

表2民猪NUMB基因与其他物种NUMB基因氨基酸序列比较结果Table 2 Nucleotide and amino acid similarities of Min pig NUMB with those of NUMB of other species

续表

图3基于NUMB基因氨基酸序列分子进化树Fig. 3 Phylogenetic tree based on the amino acid sequence of NUMB gene

2.4不同组织NUMB mRNA表达

通过实时定量PCR方法检测并分析NUMB mRNA在民猪大肠、背肌、肺、脂肪、心脏、脾、肝脏、腿肌组织中表达情况。结果表明，NUMB基因在肺中表达量最高，大肠中表达量最低。各组织相对表达量值和统计分析结果见图4。

图4民猪NUMB基因8个组织中相对定量表达情况Fig. 4 Expression of Min pig NUMB gene in eight tissue

3讨　论

NUMB又称细胞命运决定因子，是与细胞内膜相连的磷酸酪氨酸结合域（PTB）包含蛋白，是生物体内最重要的细胞命运决定因子之一。本试验通过RT-PCR方法，扩增得到全长2 004 bp产物。试验中采集8个组织中，在mRNA水平上均有NUMB基因表达，但相对表达量存在差异，肺中表达量最高，大肠中最低。NUMB基因在各种组织中表达水平高低与民猪健康状况、采样日龄及饲喂条件等诸多外在因素有关，同时也与各组织内调控网络有关，因此推测其各组织表达在整个生长发育期内是变化的。根据本试验测得序列，同时结合已有序列构建进化树表明，NUMB基因在进化上比较保守，猪与牛、骆驼同源性最高，与斑马鱼同源性最低。同源性分析发现，各物种间NUMB蛋白保守性高，与鱼和果蝇也有一定相似性，在神经系统发育中也起重要作用。NUMB表达量降低，一方面可能在寒冷刺激下肝细胞分化受抑制，另一方面拮抗Notch1通路，促进T淋巴细胞分化，抑制B淋巴细胞分化，促进体液免疫。

目前，NUMB基因抗病研究较深入，动物抗寒研究处于初期阶段。如王跃等利用细胞免疫荧光技术、免疫共沉淀技术及Western Blot检测发现NUMB蛋白上调α-syn蛋白寡泛素化水平，并参与诱导α-syn包涵体形成，可能有助于寻找阻断Lewy小体形成的新干预靶点，为帕金森病早期治疗提供新手段[13]。洪健等通过免疫组化（IHC）方法，结果均表明NUMB基因可能在肝癌中发挥抑癌基因作用，其表达缺失可促进肝癌发生发展，导致患者预后不良[14]。值得注意的是免疫系统与神经内分泌系统密切相关，NUMB在神经发育中起重要作用，低温可能阻止细胞内分化而促进神经方向的分化。

北方民猪抗寒性表现与南方地方猪种具有多种不同生理生化反应[15]。民猪作为我国地方优质猪种，经多年繁衍，适应我国北方地区寒冷气候和生活环境，比外来猪种抗逆性强。另外，温度降低可降低组织器官代谢率，对心、脑、肝脏等主要脏器功能产生明显保护作用[16]。因此，民猪抗寒特性相关基因研究尤为重要。通过本试验研究发现，民猪大肠预冷刺激，NUMB基因在转录水平上发生显著下降，推测NUMB基因在民猪抗寒特性方面具有重要作用。

4结论

本研究成功克隆民猪NUMB基因完整编码区序列，对其进行生物信息学分析。研究发现，民猪大肠、背肌、肺、脂肪、心脏、脾、肝脏、腿肌组织中均有表达，但存在组织差异，肺中表达量最高，大肠中表达量最低。根据本课题组前期研究发现，民猪肌肉组织在受到冷刺激后，NUMB基因转录水平显著下降，基于该基因在其他物种中已知生物学功能，验证NUMB基因作为研究民猪抗寒特性候选基因。同时也为日后深入研究NUMB基因抗寒特性奠定基础。

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Cloning and tissue expression analysis of Min pig NUMB gene

LIU Di1,2, WANG Xinxin1, BIE Shu1, ZHANG Dongjie2, WANG Liang2, LI Ling1, CAO Yue1(1. School of Animal Sciences and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Institute of Animal Husbandry of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China)

Abstract:In this study, RT-PCR technology combined with cloning and sequencing methods, cloned the full-length gene sequence NUMB 2 004 bp, including 1 782 bp open reading frame (ORF), which encodes 592 amino acids. Bioinformatics analysis software for prediction and analysis of the amino acid sequence of the gene discovery: NUMB protein secondary structure, a large proportion of the corner, and the proteins more hydrophilic, structural domains of the protein peptides found after analysis there was a chain of N-terminal tyrosine phosphatase domain (PTB), located between the first amino acid 37-162. Constructed based on different species NUMB protein sequence phylogenetic tree showed that kinship pigs with cattle and camels recently, with the zebra fish furthest. At the mRNA level, NUMB had highest gene expression in the lung, lowest expression in colon.

Key words:Min pig; NUMBgene; RT-PCR; cloning; bioinformatics

作者简介：刘娣（1963-），女，教授，博士，博士生导师，研究方向为动物遗传育种与繁殖。E-mail：liudi1963@163.com

基金项目：黑龙江省科技厅攻关项目（GC12B311）；国家生猪产业技术体系岗位科学家项目（CARS-36）

收稿日期：2015-11-26

中图分类号：S858.28；Q785

文献标志码：A

文章编号：1005-9369（2016）01-0051-07