跑台训练对大鼠脑缺血再灌注损伤后胶质纤维酸性蛋白和脑源性神经营养因子表达的影响①

谢宏文，谢旭光



跑台训练对大鼠脑缺血再灌注损伤后胶质纤维酸性蛋白和脑源性神经营养因子表达的影响①

谢宏文1，谢旭光2

[摘要]目的观察跑台训练对大鼠脑缺血再灌注损伤后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响。方法成年雄性Wistar大鼠30只随机分为假手术组、模型组和跑台训练组，每组10只。采用线栓法制备大脑中动脉阻塞2 h再灌注模型。假手术组插线10 mm后即刻退出。跑台训练组在造模成功后第3天进行跑台训练12 d，在造模后第4、8、15天采用改良神经功能缺损评分(mNSS)对各组大鼠评分，造模后第15天HE染色观察脑组织病理学变化，Western blotting检测BDNF和GFAP表达。结果造模后15 d，与模型组比较，跑台训练组mNSS评分明显降低(F=9.931, P<0.01)，缺血侧皮质脑组织病理损伤减轻，GFAP(t=6.73)和BDNF(t=3.78)表达明显升高(P<0.01)。结论跑台训练可促进大鼠脑缺血再灌注损伤后GFAP和BDNF的表达，促进神经功能的恢复。

[关键词]跑台训练；缺血再灌注；胶质纤维酸性蛋白；脑源性神经营养因子；大鼠

[本文著录格式]谢宏文，谢旭光.跑台训练对大鼠脑缺血再灌注损伤后胶质纤维酸性蛋白和脑源性神经营养因子表达的影响[J].中国康复理论与实践, 2016, 22(2): 132-135.

CITED AS: Xie HW, Xie XG. Effects of treadmill training on expression of glial fibrillary acidic protein and brain-derived neurotrophic factor in rats with cerebral ischemia-reperfusion [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(2): 132-135.

作者单位：1.聊城市人民医院康复医学科，山东聊城市252000；2.聊城市疾病预防控制中心检验科，山东聊城市252000。作者简介：谢宏文(1967-)，女，汉族，山东聊城市人，主管技师，主要研究方向：脑血管病康复。E-mail: xhwlfr@163.com。

近年来，缺血性脑血管病的发病率逐年升高，已经成为人类致死和致残的主要疾病之一[1]。如何最大程度减轻脑缺血再灌注带来的损伤，保护受损的神经细胞，一直是研究的热点。研究表明，早期合理运动训练能促进缺血性脑卒中患者神经功能恢复，提高患者的生存质量[2-4]。但有关运动训练对脑缺血再灌注损伤的作用机制目前有待进一步阐明。

本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血模型，观察跑台训练对胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

清洁级雄性Wistar大鼠30只，体质量230～250 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。随机分为假手术组、模型组和跑台训练组，每组10只。

1.2主要试剂和设备

BDNF一抗、GFAP一抗：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。内参β-actin：SANTA CRUZ公司；BCA蛋白质定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒：江苏碧云天生物公司。电动跑台：北京硕林苑科技有限公司。

1.3模型制备

实验前将动物置于实验室适应环境1周，自由进食、饮水，室温(23±2)℃，术前禁食12 h。参考Longa方法[5]，应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立缺血2 h再灌注24 h模型。术中和术后用恒温电热毯保持动物肛温36～37℃。假手术组插线10 mm后即刻退出。大鼠清醒后采用Longa法[5]对大鼠神经行为学评分，将得分为2～3分的大鼠纳入实验。

1.4跑台运动训练

跑台训练组于术后第3天进行跑台训练，每天30 min，共12 d。平板斜度0°；训练第1、2天履带传输速度10 m/min，训练第3天及以后20 m/min。假手术组和模型组同样抓取，但不进行跑台训练。

1.5神经功能评分

术后4 d、8 d、15 d采用改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score, mNSS)[6]评估各组大鼠神经功能变化。总分18分，分数越高，神经系统功能损害越严重。

1.6 HE染色

术后15 d，10%水合氯醛400 mg/kg麻醉后打开腹腔，依次用生理盐水、4%多聚甲醛灌注后，断头取脑，置于4%多聚甲醛固定。脑组织常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，自视交叉后连续冠状位切片，片厚5 μm。切片常规脱蜡水化，蒸馏水冲洗后，行HE染色，光学显微镜下观察脑组织病理变化。1.7 Western blotting

术后15 d，取-80℃保存的缺血侧皮层100 mg，加入预冷细胞裂解液400 μl，充分研磨，4℃12000 r/ min离心20 min，取上清液，采用BCA法进行蛋白定量，并将蛋白样品标准化。取30 μg蛋白样品，用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用10%脱脂牛奶封闭1 h后分别加入GFAP一抗(1∶1000)、BNDF一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜。TBST洗3次，每次15 min。在膜上加入生物素标记二抗后室温孵育1.5 h，TBST洗膜3次后用ECL化学发光法显色，曝光后保存图片，以β-actin为内参，应用Quantity One分析软件对蛋白条带进行灰度扫描。

1.8统计学分析

2　结果

将模型制备失败的3只大鼠及死亡的2只大鼠均予以剔除并补充，最终各组纳入分析的仍为10只大鼠。

2.1 mNSS评分

术后4 d、8 d，跑台训练组mNSS评分较模型组低，但无显著性差异(P>0.05)。术后15 d，跑台训练组mNSS评分明显低于模型组(P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠mNSS评分比较

2.2 HE染色

假手术组大鼠皮层组织结构完整，胞浆、胞核结构清晰，神经细胞、胶质细胞和毛细血管形态分布正常。模型组皮层神经细胞数量减少，胞浆、胞核界限不清，核固缩和核溶解，细胞明显肿胀坏死。与模型组相比，跑台训练组神经细胞数量增多，细胞形态相对规则，核固缩和核溶解减轻，水肿减轻。见图1。

2.3 Western blotting

与假手术组相比，模型组缺血侧皮层组织中GFAP、BDNF蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组相比，跑台训练组大鼠缺血侧皮层组织中GFAP、BDNF蛋白明显升高(P<0.01)。见图2、表2。

图1　各组大鼠缺血侧皮层组织病理学改变(HE染色，200×)

图2　各组大鼠Western blotting检测结果

表2　各组大鼠GFAP与BNDF蛋白表达比较

3　讨论

近年来，随着社会的进步和医疗水平的提高，脑卒中的死亡率有明显下降趋势，但致残率仍居高不下，其中缺血性脑卒中占大多数，如何降低其致残率是一大难题。国内外研究发现，运动训练的早期介入，可明显提高脑卒中患者的功能恢复率，其神经康复机制可能与激活内源性保护机制、促进生长因子的分泌、抑制谷氨酸释放、炎症因子改变、减少凋亡等机制相关[7-9]。跑台训练作为一种经典的运动训练方式，能够很好地模拟人类肢体运动训练，与游泳、运动转鼓、跳台等运动方式相比，跑台训练可以更加精确地调控大鼠的运动负荷等。

本实验采用mNSS评分来反映各组大鼠神经行为方面的改变。结果显示，假手术组大鼠神经评分为0分，说明假手术组大鼠没有神经功能损伤；模型组及跑台训练组出现神经功能缺损，说明模型组及训练组大鼠均有一定程度的皮质缺血，造模较理想；跑台训练组经过12 d的训练后，mNSS评分明显优于模型组，且病理组织学显示神经细胞结构好转，证实跑台训练能够很好地促进脑缺血后受损神经功能的恢复，这与之前的研究结果基本一致[10-12]。

神经功能的恢复必然有其相应形态变化作为基础，神经干细胞再生是脑缺血损伤后神经功能障碍恢复的基础之一，这些增殖的神经干细胞转移到脑组织的缺血区周围分化成神经元和星形胶质细胞[13]。星形胶质细胞在中枢神经系统数量最多、分布最广，除了营养、支持作用外，星形胶质细胞还可以促进神经修复和组织再生[14]。GFAP主要存在于星形胶质细胞内，被认为是星形胶质细胞成熟的标志，是星形胶质细胞特有的细胞骨架蛋白，对于维持星形胶质细胞形态结构的稳定起着重要作用，并决定着星形胶质细胞对神经损伤反应的程度[15-16]。GFAP在生理情况下少有表达，脑缺血时星形胶质细胞激活，大量GFAP表达增高，对脑内环境稳定及神经元存活和可塑性修复起着重要作用[17]。Lee等对脑缺血大鼠进行不同强度的运动训练，轻中度的运动训练能够很好地减少脑梗死面积，增加缺血区星形胶质细胞的表达[18]。有研究用GFAP缺失的小鼠制作脑缺血模型，发现其对脑缺血损伤有更高的敏感性[19-20]。

本实验通过检测缺血皮层区GFAP表达变化，反映跑台训练对脑缺血再灌注后星形胶质细胞的变化，实验结果表明，脑缺血后模型组和跑台训练组GFAP表达明显增多，以跑台训练组尤其显著，表明经过跑台训练可通过促进脑缺血组织周围GFAP表达为受损的神经元提供保护作用。

星形胶质细胞对于神经元的营养、修复等多种功能是通过分泌大量的神经营养因子及细胞因子实现的，如血管内皮生长因子、BDNF、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长等[21]，其中BDNF不仅在胚胎神经元的发生、发育和存活过程中发挥着重要作用，而且对发育成熟的神经元功能的产生及维持起着重要作用[22]。在脑缺血损伤后BDNF可通过稳定钙离子浓度、减少自由基损伤、抑制凋亡、促进神经元再生等方面促进损伤神经功能的恢复[23-25]。

本实验观察到，经过跑台训练后大鼠脑缺血皮层组织中BDNF蛋白表达较模型组升高，表明跑台训练可促进缺血脑组织周围星形胶质细胞增殖活化，分泌多种神经营养因子参与神经修复，从而起到神经保护作用。

本研究结果表明，跑台训练可以促进脑缺血后GFAP和BDNF的表达，从而促进脑缺血再灌注损伤后神经功能的恢复。不同强度、不同频率、不同时间的跑台训练作用效果如何尚需要进一步研究。

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Effects of Treadmill Training on Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein and Brain-derived Neurotrophic Factor in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

XIE Hong-wen1, XIE Xu-guang2
1. Department of Rehabilitation Medicine, Liaocheng People's Hospital, Liaocheng, Shandong 252000, China; 2. Department of Laboratory, Liaocheng Center for Disease Control and Prevention, Liaocheng, Shandong 252000, China

Correspondence to XIE Hong-wen. E-mail: xhwlfr@163.com

Abstract:Objective To explore the effect of treadmill training on expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Methods 30 male Wistar rats were randomly divided into sham group, model group and treadmill training group, with 10 rats in each group. The latter 2 groups were modeled with middle cerebral artery occlusion for 2 hours and reperfusion. The treadmill training group underwent treadmill exercise on the 3rd day after modeling for 12 days. Neurological function was evaluated with modified Neurological Severity Scores (mNSS). The neuronal pathological change in ischemic cortex was observed with HE staining. The expressions of GFAP and BDNF in cortex were determined by Western blotting. Results Compared with the model group, the mNSS scores decreased in the treadmill training group (F=9.931, P<0.01), the pathological damage in the ischemia cortex significantly lessened, and the expressions of GFAP (t=6.73) and BDNF (t=3.78) increased (P<0.05). Conclusion Treadmill training may increase the expression of GFAP and BDNF after cerebral ischemia-reperfusion in rats, and promote the recovery of neurological function.

Key words:treadmill training; ischemia-reperfusion; glial fibrillary acidic protein; brain-derived neurotrophic factor; rats

(收稿日期：2015-11-06修回日期：2016-01-12)

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.02.002

[中图分类号]R743.3

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2016)02-0132-04