特色饮料“生命营养液”内源菌株CICC 10822的鉴定及生物学特性

曹艳花，亚森·克力木，姚 粟，刘 洋，翟 磊，赵 婷，程 池*

(1.中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.新疆埃杜升生物开发有限公司，新疆乌鲁木齐 830000)



特色饮料“生命营养液”内源菌株CICC 10822的鉴定及生物学特性

曹艳花1，亚森·克力木2，姚 粟1，刘 洋1，翟 磊1，赵 婷1，程 池1*

(1.中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.新疆埃杜升生物开发有限公司，新疆乌鲁木齐 830000)

摘要[目的]鉴定特色饮料“生命营养液”内源菌株CICC 10822并了解其生物学特性。[方法]采用传统微生物学分离培养方法对30 ℃条件下分离得到的新疆埃杜升“生命营养液”细菌CICC 10822进行多相分类鉴定。[结果]菌株CICC 10822接触酶反应阴性，硝酸盐还原阴性，淀粉水解阴性，精氨酸双水解酶阴性；能利用葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，不能利用麦芽糖、木糖、甘油、乳糖、甘露糖、山梨醇、纤维二糖、鼠李糖、阿拉伯糖，不液化明胶。利用基于形态学观察、生理生化特征分析及16S rDNA和pheS基因序列系统发育分析的微生物多相分类鉴定技术，将菌株CICC 10822鉴定为酸鱼乳杆菌(Lactobacillusacidipiscis)。[结论]试验结果为今后开展针对该菌的生物学功能研究奠定了基础。

关键词生命营养液；CICC 10822；鉴定；酸鱼乳杆菌；生物学特性

随着科学技术的发展，传统食品除其经典的营养作用外，还被发现有保健功能。新疆埃杜升“生命营养液”是以核桃、巴旦木、杏仁、黄豆、绿豆、大米以及干、鲜果类和蔬菜类等50多种天然食品为原料，经独特的方法多次发酵制备而成的特色功能性饮料，已申请获得发明专利[1]。在新疆地区维吾尔族常饮用“生命营养液”用于营养保健，其富含蛋白质、粗脂肪、维生素、矿物质、纤维素和功能因子，能够有效提供充足营养、提高人体免疫力，对多种炎症的控制和辅助治疗具有积极的效果[2]。

中国食品发酵工业研究院已对新疆埃杜升“生命营养液”这种特色发酵制品初步进行了微生物的研究，发现其对常见食源性致病菌均有抑菌能力，对常见益生菌无抑菌能力。例如，“生命营养液”对沙门氏菌肠亚种(Salmonellaentericasubsp.enterica)、出血性大肠埃希氏菌(EscherichiacoliEHEC O 157∶H7)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等多种致病菌具有抑菌活性[3]；“生命营养液”具有体外抗HIV-1活性[4]。基于此，笔者以自“生命营养液”中分离筛选得到的细菌菌株CICC 10822为研究对象，对其进行多相分类鉴定及相关酶活性、碳源利用等生物学特性研究，以期为进一步研究其生物功能与“生命营养液”功效性成分之间的相关性奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株。供试菌株为中国食品发酵工业研究院自新疆埃杜升“生命营养液”中分离获得，样品由新疆埃杜升生物开发有限公司提供。

1.1.2培养基。MRS培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.1.3主要试剂。细菌基因组DNA提取试剂盒、dNTPs、TaqDNA聚合酶及DNA Marker等购自天根生化科技有限公司；生理生化鉴定管购自北京陆桥技术股份有限公司；其他化学试剂均为分析纯产品。

1.2方法

1.2.1菌株分离、纯化与保藏。采用稀释平板涂布法[3]对“生命营养液”中细菌进行分离筛选。梯度稀释以制备1×10-6～1×10-2的系列稀释液，涂布MRS平板，并置于30 ℃培养箱中培养48 h。待单菌落出现后，采用划线法转接至MRS斜面培养后置于4 ℃保藏。同时将分离的菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

1.2.2形态学观察。将菌株CICC 10822接种于MRS固体培养基，置于30 ℃培养48 h后，观察其特征，并利用光学显微镜及电子显微镜观察菌体形态特征[3]。

1.2.3生理生化特征鉴定。采用生理生化鉴定管对菌株CICC 10822的酶活性、碳源利用等生理生化特征进行检测，具体操作方法按生理生化鉴定管说明书进行。

1.2.416S rDNA序列系统发育分析。 采用Tiangen细菌基因组DNA提取试剂盒提取CICC 10822菌株基因组DNA，具体方法参见说明书。 采用27F和1492R为引物扩增细菌CICC 10822的16S rDNA[5-7]。测定序列通过EzBioCloud数据库进行比对及近缘种序列相似度计算[8]，并将测定序列提交至GenBank。利用ClustalX 1.83按照最大同源性的原则对测定序列及其模式菌株序列进行比对，并用MEGA 5.0软件以邻接法构建系统发育树[9]，自展值设为1 000分析评估进化树的稳定性，对菌株CICC 10822进行系统发育分析[7，10]。

1.2.5持家基因序列分析。以菌株CICC 10822基因组DNA为模板，采用苯丙氨酰tRNA合成酶α亚基基因(pheS)特异性引物进行扩增，正向引物(pheS-21F)为5′-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3′，反向引物(pheS-22R)为5′-CCWARVCCRAARGCAAARCC-3′[5]。PCR扩增并测序构建系统发育树[8]，自展值设为1 000分析评估进化树的稳定性，进行系统发育分析[7，10]。

2结果与分析

2.1菌株CICC 10822的分离纯化与形态学观察经过分离纯化获得的菌株命名为B4，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌株保藏编号为CICC 10822。CICC 10822在MRS培养基上30 ℃培养48 h，菌落为圆形，不透明，乳白色，湿润，边缘整齐(图1a)；光学显微镜观察显示菌体大小为0.4×(1.2～4.0) μm，呈杆状，单个排列或者成对排列，革兰氏阳性(图1b)。

2.2菌株CICC 10822生理生化特征分析经生理生化鉴定管对菌株CICC 10822的酶活性、碳源利用等生理生化特征进行检测，结果表明CICC 10822接触酶反应阴性，硝酸盐还原阴性，淀粉水解阴性，精氨酸双水解酶阴性。能利用葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，不能利用麦芽糖、木糖、甘油、乳糖、甘露糖、山梨醇、纤维二糖、鼠李糖、阿拉伯糖，不液化明胶(表1)。

2.316S rDNA序列系统发育分析菌株CICC 10822的16S rDNA的PCR扩增产物大小约为1 500 bp，在GenBank上的登录号为KM259929。将该序列通过EzBioCloud数据库进行比对，比对结果显示同CICC 10822的16S rDNA序列相似性高于97%的序列只有2个，都是乳杆菌属的模式菌株序列，其中菌株CICC 10822同酸鱼乳杆菌(Lactobacillusacidipiscis)模式株的16S rDNA序列相似性最高为99.73%，同Lactobacilluspobuzihii模式株的16S rDNA序列相似性为98.32%。以同科不同属的片球菌属的PediococcusdamnosusJCM 5886T序列为外群，构建CICC 10822与相关近缘模式菌株的系统发育树(图2)。通过16S rDNA序列系统发育分析可将菌株CICC 10822鉴定为乳杆菌属(Lactobacillussp.)。

2.4持家基因序列系统发育分析菌株CICC 10822的pheS基因PCR扩增产物大小约为500 bp，在GenBank上登录号为KM259930。通过Blast软件进行比对，结果显示CICC 10822菌株pheS基因序列与酸鱼乳杆菌(Lactobacillusacidipisci)模式菌株序列相似性最高为98.00%，而同乳杆菌属其余菌株pheS基因序列相似性均低于96.00%。以同科不同属的片球菌属的PediococcusdamnosusLMG 11484T序列为外群，构建CICC 10822与相关近缘模式菌株系统发育树(图3)。pheS基因序列系统发育分析显示菌株CICC 10822被鉴定为酸鱼乳杆菌(Lactobacillusacidipisci)。

表1菌株CICC 10822的生理生化特征

Table 1The physiological and biochemical characteristics of strain CICC 10822

注：“+”.阳性；“-”.阴性。

Note：“+”.Positive；“-”.Negative.

2.5菌株CICC 10822多相分类鉴定结果通过形态学观察并进行16S rDNA和pheS持家基因序列系统发育分析，结

合微生物代谢类型差异，检测微生物对各种基质代谢作用及其代谢产物，从而鉴定评价待检微生物的分类学地位。结合菌体形态及菌落形态特征观察、生理生化特征分析及16S rDNA和pheS持家基因序列系统发育分析结果，“生命营养液”菌株CICC 10822被鉴定为酸鱼乳杆菌(Lactobacillusacidipisci)。

3结论与讨论

该研究对菌株CICC 10822的菌体形态及菌落形态特征进行观察，经生理生化鉴定管对菌株CICC 10822的酶活性、碳源利用等生物学特征进行检测，结果表明CICC 10822接触酶反应阴性，硝酸盐还原阴性，淀粉水解阴性，精氨酸双水解酶阴性。能利用葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，不能利用麦芽糖、木糖、甘油、乳糖、甘露糖、山梨醇、纤维二糖、鼠李糖、阿拉伯糖，不液化明胶，其生理生化结果符合乳杆菌属(Lactobacillussp.)的特征[11-13]。通过16S rDNA的PCR扩增与测序，采用EzBioCloud数据库进行序列比对并利用MEGA 5.0软件进行系统发育学分析，菌株CICC 10822被鉴定为乳杆菌属。进一步通过pheS基因序列系统发育分析，序列比对结果显示CICC 10822同酸鱼乳杆菌模式菌株的亲缘关系最近为98.00%，与乳杆菌属其余菌株相似性均低于96.00%。综上，结合菌体形态、菌落形态特征观察及生理生化特征分析，通过16S rDNA和pheS持家基因系统发育分析，确定新疆埃杜升“生命营养液”菌株CICC 10822为酸鱼乳杆菌。

酸鱼乳杆菌由Tanasupawat 等[14]于2000年从发酵的鱼中分离获得。酸鱼乳杆菌的分类地位属于细菌界厚壁菌门乳杆菌科乳杆菌属的菌种。塞浦路斯干奶酪乳杆菌(Lactobacilluscypricasei)由Lawson等[15]于2001年从芝士奶酪中分离获得，后经Naser等[16]于2006年研究报道证实Lawson等于2001年发表的塞浦路斯干奶酪乳杆菌是酸鱼乳杆菌的同物异名。该研究中自新疆埃杜升“生命营养液”中发现并分离得到CICC 10822为酸鱼乳杆菌尚属国内首次。研究发现CICC 10822能够利用葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，CICC 10822在“生命营养液”发酵过程中的作用和功能以及“生命营养液”功效性成分物质产生方面是否发挥一定的作用，还有待于进一步的发酵试验和产业化应用研究。该研究利用微生物多相分类鉴定技术对菌株CICC 10822的分类地位进行全面准确的鉴定，为今后开展其生物学功能的相关研究、充分利用该菌的生物活性和代谢产物、实现其产业利用价值奠定了微生物资源基础。

参考文献

[1] 亚森·克力木.一种保健营养液及其制备方法：中国，201110111492.8[P].2011-11-02.

[2] 新疆埃杜升生物开发有限公司.埃杜升生命营养液[EB/OL].[2014-06-01].http：//www.aldost.com/cn/product_show.php? id=1.

[3] 赵婷，吾布利·卡地尔，翟磊，等.新疆“生命营养液”抑菌能力评价及其菌种分离纯化[J].食品科学技术学报，2014，32(6)：54-60.

[4] 陈建国，梁寒峭.新疆“生命营养液”体外抗HIV-1活性的分析[J].安徽农业科学，2015，43(19)：8-9.

[5] NASER S M，DAWYNDT P，CLEENWERCK I，et al.Identification of lactobacilli bypheSandrpoAgene sequence analyses[J].Int J Syst Evol Microbiol，2007，57：2777-2789.

[6] 程池，曹艳花，姚粟，等.海巴戟天(诺尼)果内生细菌的初步分离与鉴定[J].食品科技，2014，39(3)：7-12.

[7] 刘洋，曹艳花，程池，等.1株西沙群岛野生诺尼种子内生细菌CICC 10599的分离与鉴定[J].食品与发酵工业，2014，40(6)：65-69.

[8] YANG L，SHAN Z，LIWEN X，et al.Study on diversity of endophytic bacterial communities in seeds of hybrid maize and their parental lines[J].Archives of microbiology，2012，194：1001-1012.

[9] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，2011，28(10)：2731-2739.

[10] YANG L，SHAN Z，YUANYUAN Z，et al.Investigation on diversity and population succession dynamics of endophytic bacteria from seeds of maize (ZeamaysL.，Nongda108)at different growth stages[J].Annals of microbiology，2013，63：71-79.

[11] DE VOS P，GARRITY G M，JONES D，et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology[M].Second Edition.Philadelphia,PA:Lippincott Williams & Wilkins，2009.

[12] BUCHANAN R E，GIBBONE E N.伯杰氏细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所，译.8版.北京：科学出版社，1984：797-830.

[13] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：267-295.

[14] TANASUPAWAT S，SHIDA O，OKADA S，et al.Lactobacillusacidipiscissp.nov.andWeissellathailandensissp.nov.，isolated from fermented fish in Thailand[J].Int J Syst Evol Microbiol，2000，50(4)：1479-1485.

[15] LAWSON P A，PAPADEMAS P，WACHER C，Et al.Lactobacilluscypricaseisp.nov.，isolated from Halloumi cheese[J].Int J Syst Evol Microbiol，2001，51(1)：45-49.

[16] NASER S M，VANCANNEYT M，HOSTE B，et al.LactobacilluscypricaseiLawson et al.2001 is a later heterotypic synonym ofLactobacillusacidipiscisTanasupawat et al.2000[J].Int J Syst Evol Microbiol，2006 56(7)：1681-1683.

Identification and Biological Characteristics of Bacterial Strain CICC 10822 Isolated from Aldos Life Nutrition Liquid

CAO Yan-hua1, Yasin kirim2, YAO Su1, CHENG Chi1*et al

(1. China Industrial Microbial Strains Preservation and Management Center, China Food Fermentation Industry Research Institute, Beijing 100015; 2. Xinjiang ALDOS Biological Development Co. Ltd., Urumqi, Xinjiang 830000)

Key wordsLife nutrition liquid; CICC 10822; Identification;Lactobacillusacidipiscis; Biological characteristics

Abstract[Objective] The aim was to identify bacterial strain CICC 10822 isolated from Aldos life nutrition liquid and under the biological characteristics. [Method] By using the traditional microbiology separation and culture method, bacterial strain CICC 10822 isolated from Xinjiang Aldos life nutrition liquid in 30 ℃ was classified and identified. [Result] Strain CICC 10822 contact enzyme reaction was negative, nitrate reduction was negative, starch hydrolysis was negative, and arginine was negative. It could utilize glucose, fructose, ribose and galactose, and could not use maltose, xylose, lactose, glycerol, mannitol, sorbitol, cellobiose, rhamnose, arabinose, liquefied gelatin. By using microbial taxonomy and identification technology based on morphological observation, physiological and biochemical characteristics analysis, phylogenetic analysis of 16S rDNA andpheSgene sequences, strain CICC 10822 was identified asLactobacillusacidipiscis. [Conclusion] The results lay a foundation for study on the bacterial biological functions in the future.

基金项目国家微生物资源平台专项(NIMR2016-4)；中国食品发酵工业研究院科技发展基金(博士基金)项目(2012KJFZ-BS-01)。

作者简介曹艳花(1985- )，女，黑龙江讷河人，工程师，硕士，从事微生物分类鉴定研究。*通讯作者，教授级高级工程师，从事微生物学研究。

收稿日期2016-02-19

中图分类号TS 275.4

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-107-04