尼罗罗非鱼cyp17a2生物信息学和雌雄性腺表达差异分析

王伟伟　(山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)



尼罗罗非鱼cyp17a2生物信息学和雌雄性腺表达差异分析

王伟伟(山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

摘要[目的]进一步研究尼罗罗非鱼cyp17a2的编码蛋白的P450c17-Ⅱ的生物学特征以及在性腺中的表达特点。[方法]根据NCBI网站上登录的尼罗罗非鱼的cyp17a2基因全编码序列，利用相关的生物信息学分析软件分析cyp17a2基因编码的P450c17-Ⅱ的理化性质和结构特点，并分析该基因在不同性腺中的表达。[结果]罗非鱼cyp17a2基因编码的多肽含有521个氨基酸，pI为8.09，脂溶指数为98.33，是不稳定蛋白。罗非鱼cyp17a2基因的二级结构以不规则卷曲所占比例最大，为58.16%，α-螺旋占22.07%。P450c17-Ⅱ是二次跨膜蛋白，有众多蛋白质翻译后修饰位点。在60日龄性腺中，cyp17a2在精巢中的表达量显著高于卵巢。[结论]cyp17a2在尼罗罗非鱼不同性腺中的差异表达和编码P450c17-Ⅱ的生物信息学分析为研究cyp17a2在繁殖过程中的作用奠定了基础。

关键词尼罗罗非鱼；cyp17a2；性腺；生物信息学

性类固醇激素在大多数脊椎动物的繁殖中发挥着重要作用，细胞色素P450c17是类固醇激素生物合成通路的重要酶，具有17，20-裂解酶活性和17a-羟基化酶活性[1]。

在哺乳动物和低等脊椎动物中只发现1种P450c17，而在一些硬骨鱼类中发现了2种不同基因编码的细胞色素P450c17s，为P450c17-I 和P450c17-Ⅱ[2]，它们分别由cyp17和cyp17a2所编码。P450c17-I具有17，20裂解酶和17a-羟化酶活性，而P450c17-Ⅱ仅具有17a-羟化酶活性。很多鱼类的cyp17 基因已经得到克隆，而cyp17a2基因只在部分鱼类中得到克隆[3]。

对于新发现的编码鱼类特有的cyp17a2的表达做过相关的研究，在牙鲆的成年鱼中cyp17a2的表达量在头肾组织中最高，其在卵巢、精巢和脑中的表达量次之，而在其他组织中未检测到[4]。在半滑舌鳎中，cyp17a2基因在卵巢中的时间表达与性腺发育呈正相关，而在精巢中的时间表达与性腺发育呈负相关[5]。

尼罗罗非鱼是世界性的养殖鱼类，cyp17a2基因已经被克隆[6]，并发现其在头肾和性腺表达。在8月龄罗非鱼精巢的间质细胞上有表达，在卵巢中仅在前卵黄期卵母细胞的膜细胞上有表达。在卵母细胞成熟周期中，cyp17a2对卵母细胞的成熟是必需的，其表达模式与芳香化酶一致。

作为甾体激素合成通路中重要的酶，利用生物信息学的方法全面分析罗非鱼cyp17a2基因编码的蛋白结构和功能，有助于获取该基因更多的信息。2月龄的罗非鱼雌雄幼鱼分别处于精子发生和卵黄积累的关键时期。笔者根据NCBI网站上登录的尼罗罗非鱼的cyp17a2基因全编码序列，利用相关的生物信息学分析软件分析cyp17a2基因编码的P450c17-Ⅱ的理化性质和结构特点，并对该阶段雌雄性腺中cyp17a2的表达进行分析，旨在为进一步研究cyp17a2在鱼类繁殖过程中的作用奠定基础。

1材料与方法

1.1罗非鱼cyp17a2基因编码的蛋白的生物信息学分析

1.1.1罗非鱼cyp17a2序列的获取。从NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载罗非鱼cyp17a2基因的CDS区序列(NM_001279458)和氨基酸序列。

1.1.2序列的生物学信息分析。利用表1中的软件和在线工具，分析cyp17a2编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、二级结构等。

1.2cyp17a2基因在尼罗罗非鱼幼鱼雌雄性腺中的表达差异

1.2.1试验动物和试剂。试验采用60日龄的雌雄尼罗罗非鱼幼鱼各6尾，经麻醉后解剖取出性腺组织，置于液氮中进行速冻，然后转移至-80 ℃超低温冰箱中保存，用于后续mRNA的提取。RNA提取试剂盒和逆转录荧光定量试剂盒，均购自大连TaKaRa公司。

1.2.2方法。

1.2.2.1mRNA的提取及cDNA第一链的合成。按照mRNA提取试剂盒说明书提取mRNA，测定mRNA的OD值后，取500 ng mRNA根据说明书(TaKaRa，Japan，DRR036A)要求合成cDNA第一链。

1.2.2.2引物的设计和荧光定量。根据NCBI网站上登录的罗非鱼cyp17a2基因CDS全长序列(NM_001279458)和18S rRNA序列(JF698683.1)，利用NCBI网站上的Primer blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/)在线软件来设计引物，引物序列如表2所示。根据荧光定量试剂盒说明书配制反应液，使用ABI 7500 荧光定量PCR仪中进行扩增，扩增程序为：预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，45个循环。

2结果与分析

2.1罗非鱼cyp17a2基因编码蛋白生物信息学分析

2.1.1罗非鱼cyp17a2编码的蛋白的基本理化性质。罗非鱼cyp17a2 CDS区有1 563 bp碱基对，编码521个氨基酸。通过ProtParam程序对罗非鱼cyp17a2氨基酸序列进行基本理化性质预测，罗非鱼cyp17a2编码氨基酸的等电点(pI)为8.09，说明该基因编码的蛋白质为碱性蛋白。罗非鱼cyp17a2的脂溶指数为98.33，说明罗非鱼cyp17a2是一种脂溶蛋白。罗非鱼cyp17a2的总平均亲水性为-0.048，为亲水性蛋白。罗非鱼cyp17a2的不稳定系数小于40，是一种稳定蛋白质。

2.1.2罗非鱼cyp17a2蛋白的跨膜区结构预测以及酶重要的功能区。HMMTOP 显示该蛋白有2个跨膜区，位于17～34和55～74，N-端位于外侧，TMHMM-2.0软件也显示该蛋白有2个跨膜区(图1)，说明该蛋白处于细胞膜上。在cyp17a2编码的氨基酸序列中发现P450c17保守的特有区域、Ozols tridecapeptide 区域(参与类固醇底物结合)和细胞色素P450 cysteine heme-iron 信号区域(图2)。

2.1.3罗非鱼cyp17a2蛋白信号肽预测。使用SignalP 4.0软件，预测cyp17a2蛋白质的信号肽，输出S、C、Y3个值，其最大C分值为0.189(红线表)，最大S分值(绿线)为0.725，最大Y分值(蓝线)为0.320(图3)，说明该蛋白没有信号肽。

2.1.4罗非鱼cyp17a2蛋白O-糖基化位点预测。对氨基酸序列进行对比分析，罗非鱼cyp17a2氨基酸序列中第43、291、292、298、299、364、445、448位点潜力值都大于0.5的阈值，是潜在的O-糖基化位点，表明罗非鱼cyp17a2的氨基酸序列中存在8个O-糖基化位点。

2.1.5罗非鱼cyp17a2蛋白N-糖基化位点预测。从图4可以看出，位于246位点的天冬酰胺(Asn)的N-糖基化潜力值为0.550 9，大于阈值(0.5)，则这个天冬酰胺为N-糖基化位点。

2.1.6罗非鱼cyp17a2蛋白磷酸化位点预测。从图5可以看出，罗非鱼crp17a2的氨基酸序列中有18个丝氨酸(Ser)和3个苏氨酸(Thr)的磷酸化潜力值均大于阈值(0.5)，表明罗非鱼cyp17a2存在21个磷酸化位点。

2.1.7罗非鱼cyp17a2蛋白二级结构预测。从图6可以看出，罗非鱼cyp17a2基因编码的521个氨基酸所组成的蛋白质中α-螺旋占22.07%，包括115个氨基酸；延伸链占19.77%，由103个氨基酸组成；不规则卷曲所占比例最大，为58.16%，包括303个氨基酸。

2.2cyp17a2基因在尼罗罗非鱼幼鱼雌雄性腺中的表达差异以18SrRNA为内参基因，通过Real-time PCR对尼罗罗非鱼的雌雄性腺cyp17a2 基因表达量进行了分析，方差分析表明，该基因在雌雄性腺中表达量差异极显著(P<0.01)，雄鱼显著高于雌鱼(P<0.05)(图7)。

3结论与讨论

该研究中以尼罗罗非鱼的cyp17a2编码的氨基酸序列为研究对象，对其功能进行分析。cyp17a2编码蛋白为脂溶性蛋白，也是碱性蛋白，比较稳定。疏水作用是蛋白质折叠的重要驱动力，是分析蛋白质跨膜区的重要一步。该蛋白虽有跨膜区，只有1个二次跨膜区域，在整个序列中占的比例很小，因此仍表现出亲水性。该蛋白有多个糖基化位点增加了蛋白质的稳定性。在cyp17a2编码的氨基酸序列中发现了P450c17保守的特有区域、Ozols 十三肽区(参与类固醇底物结合)和细胞色素P450 cysteine heme-iron 信号区域，这些区域与罗非鱼cyp17以及其他脊椎动物的cyp17编码的氨基酸序列高度保守[15]。人类的Arg358(精氨酸)对P450c17的裂解酶活性是必须的[16]，在硬骨鱼类P450c17-Ⅰ和其他脊椎动物P450c17的Arg358位于Ozols tridecapeptide region里，而在条斑星鲽[2]和罗非鱼的P450c17-Ⅱ的该位置不是Arg，而是Asn代替，这可能解释P450c17-Ⅱ只有羟化酶活性，而没有裂解酶活性的原因。

在牙鲆[4]、半滑舌鳎[5]和条斑星鲽[2]中，cyp17a2在多种鱼类的性腺中有表达，在半滑舌鳎卵巢中，cyp17a2的时间表达模式与发育呈正相关，而在精巢内表达与性腺发育呈负相关，显示不同的表达模式。在半滑舌鳎处于Ⅳ期的雌雄性腺中，精巢cyp17a2的表达量远远高于卵巢。

该试验中在60日龄的尼罗罗非鱼的幼鱼雌雄性腺中均检测到cyp17a2的表达。此时，尼罗罗非鱼性腺正分别处于卵黄积累和精子发生的关键时期，P450c17-Ⅱ的羟化酶活性在这2件重要生理事件中的作用很重要。在P450c17-Ⅱ的羟化酶活性作用下孕酮转化为17α-羟孕酮，然后在不同酶的作用下分别生成雌二醇(E2)和17α，20β-DHP，它们在卵巢分别对卵母细胞生长和卵母细胞最终成熟是必不可少的；在精巢孕激素能启动精子发生、诱导精子成熟和排精，也是间质细胞内雄激素合成的关键酶。因为P450c17-Ⅱ缺乏裂解酶活性，在罗非鱼性别分化的起始阶段(5日龄)不表达，在8日龄在雌鱼起始表达来启动17α，20β-DHP的合成，12日龄在颗粒细胞达到高峰[6]。在日本鳗鲡[17]，17α，20β-DHP对其精子发生减数分裂起始很关键。在罗非鱼中cyp17a2的起始表达与减数分裂一致。60日龄罗非鱼卵巢减数分裂已经完成，处于卵黄积累的阶段，而此时精巢处于精子发生减数分裂的前期，高表达的cyp17a2对17α，20β-DHP产生具有促进作用，从而起始减数分裂，因而在精巢高表达。在斑马鱼中也发现cyp17a2的表达与卵巢发育负相关，而与精巢发育正相关。该研究结果有助于进一步分析cyp17a2基因编码蛋白的结构以及在鱼类繁殖活动中的作用。

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Bioinformatics Analysis ofcyp17a2 in Nile Tilapia and Differences of Expression in Gonads

WANG Wei-wei

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801)

Key wordsNile tilapia;cyp17a2; Gonads; Bioinformatics

Abstract[Objective] In order to study the biological characteristics of tilapia P450c17-Ⅱ coded bycyp17a2, and expression characteristics in gonads. [Method] The physicochemical properties and construction features were analyzed using biology softwares, according to coding sequence of tilapiacyp17a2 from NCBI, andcyp17a2 expression in different gonads were analyzed. [Result] The complete coding region of tialapia encoded 521 amino acid residues. The theoreticalpIand aliphatic index was 8.09 and 98.33, respectively. P450c17-Ⅱ was basic, fat-soluble and unstable protein. Random coil was most popular in the secondary structure, and was 58.16%, alpha helix accounted for 22.07%. P450c17-Ⅱ was transmembrane, and there were a lot of post-translation modified sites in P450c17-Ⅱ. The expression ofcyp17a2 was higher in testis than in ovary in 60d tilapia. [Conclusion] The differentiation expression ofcyp17a2 in different gonads of Nile tilapia and P450c17-Ⅱ bioinformatics analysis can lay a foundation for researching the role ofcyp17a2 in propagation process.

基金项目山西农业大学创新基金项目(2010025)。

作者简介王伟伟(1979- )，女，山西晋城人，讲师，硕士， 从事水产动物遗传与育种研究。

收稿日期2016-02-26

中图分类号S 937.3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-103-04