杨树萤叶甲DNA条形码研究

席欧彦,李 晓,郑 飞,段新晨,唐秀丽,胡红英

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)



杨树萤叶甲DNA条形码研究

席欧彦,李 晓,郑 飞,段新晨,唐秀丽,胡红英

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)

摘要：【目的】杨树萤叶甲(杨毛臀萤叶甲)(Agelastica alni orientalis Baly)主要分布于新疆，是杨、柳及苹果等林果的重要食叶害虫，对作物的严重危害期通常在幼虫期，难以对此做出准确鉴定。运用DNA条形码技术可以对害虫各龄期的标本进行快速和准确的鉴定。【方法】通过提取杨树萤叶甲的基因组DNA，以线粒体细胞色素氧化酶(COⅠ)基因作为通用引物进行PCR扩增，最后获得准确的碱基序列作为杨树萤叶甲的DNA条形码。【结果】根据杨树萤叶甲在不同龄期的DNA序列一致的原理，运用DNA条形码研究技术，获得了杨树萤叶甲成虫和三龄幼虫的COⅠ基因序列，并进行了序列分析。结果显示相似性最高可达97.74%。获得的序列可以用于对杨树萤叶甲的禄步鉴定。【结论】DNA条形码技术可简单、快速、准确的鉴定不同龄期杨树萤叶甲的标本，为及时采取害虫防治措施提供基础数据。

关键词：杨树萤叶甲； DNA条形码；COⅠ基因；快速鉴定

0 引 言

【研究意义】杨树萤叶甲又名杨毛臀萤叶甲(AgelasticaalniorientalisBaly)，属鞘翅目(Coleoptera),叶甲科(Chrysomelidae)。在国内主要分布于新疆和内蒙古，在新疆境内自乌鲁木齐起，西到伊犁，北迄塔城，东抵托克逊、哈密，南自和田、喀什等地。它是新疆危害杨、柳、榆、巴旦杏、苹果树的主要食叶害虫。近几年在乌鲁木齐、昌吉和伊犁等地区的苗圃、防护林及果园为害猖獗。主要以成虫和幼虫为害，该虫虫口密度较大，取食量大，成虫取食柳叶部分的叶肉和叶脉，留下缺刻；其幼虫从柳叶背面取食柳叶的叶肉、剩下叶脉，被食害的柳叶呈网状缺刻，大大降低了柳叶的光合作用，导致柳叶枯黄、早落。严重时整棵柳树只剩下树干，它不仅危害柳树还危害杨树、榆树、苹果树等，严重影响了林木及果树的生长。而且它是五种柳树食叶害虫中危害情况最严重的害虫[1-2]。而目前对该害虫的鉴定主要根据其形态特征，对危害严重的害虫鉴定较为困难。DNA条形码不受发育阶段的影响，可为快速准确的鉴定该害虫的幼虫期提供重要依据。【前人研究进展】DNA条形码(DNA barcoding)是由加拿大Hebert等首次正式提出，是应用有足够变异的标准化短基因片段对物种进行快速、 准确鉴定的新的生物身份识别系统。具有准确性高、鉴定快速、且不受发育阶段的影响等优点[3]。随着DNA条形码技术的推进,已经发布的DNA条形码序列有168 719种,其中完整的物种DNA条形码序列 (包含准确的物种信息和条形码序列信息 )19 163个物种[4]。很多国际组织自行建立的 DNA条形码数据库构成整个DNA条形码项目的重要组成部分，比如，Birds组织计划在5年内完成所有鸟类约10 000种的DNA条形码数据库的构建,1 233种鸟类的DNA条形码数据已经得到[5]。近年来在国内昆虫条形码研究也在不断进行，主要是关于鞘翅目(Coleoptera)、直翅目(Orthoptera)、半翅目(Hemiptera)、鳞翅目(Lepidoptera)的天蛾和卷蛾、双翅目(Diptera)实蝇与寄蝇、膜翅目中国榕小蜂的相关研究进展。DNA 条形码作为当代生命科学领域最为活跃的学科之一受到重视。在全球已知鞘翅目种类36×104余种，占全球已知昆虫总数的1/3，中国记载约1×104余种。鞘翅目昆虫数量众多，国内外学者对鞘翅目不同分类阶元的系统发育问题进行了广泛而深入的研究。国内研究方面利用线粒体基因部分序列对鞘翅目昆虫系统发育关系的研究较多，对DNA条形码的研究并不是很多。到目前为止( 2014年2 月) ，GenBank 上共提交鞘翅目线粒体全基因组( 或者近线粒体全基因组) 共74个，而针对杨树萤叶甲的全基因组序列测定的则没有[6-10]。【本研究切入点】目前对杨树萤叶甲幼虫的形态学鉴定较为困难，而DNA条形码技术能快速鉴定各龄期昆虫。因而研究基于杨树萤叶甲DNA条形码缺少的情况，选择昆虫条形码通用基因线粒体DNA[11]，对不同龄期的杨树萤叶甲的COⅠ基因进行扩增、测序，为其快速、准确鉴定提供科学依据。因此，利用线粒体DNA来测出杨树萤叶甲的序列对快速的鉴定杨树萤叶甲有很重要的意义。【拟解决的关键问题】DNA barcoding 的技术流程比较简洁，主要包括样品获取、DNA提取、PCR扩增、序列测定、序列比对及根据序列差异进行判别。通过获得准确的序列来对杨树萤叶甲进行快速的鉴定，以便为及时采取害虫防治措施提供基础数据，为自治区农林业的发展作出贡献[12]。

1材料与方法

1.1　材 料

在新疆大学和新疆医科大学等校园内柳树上捕捉杨树萤叶甲成虫，采摘大量带有卵块的叶片。

1.2　 方 法

1.2.1 杨树萤叶甲的室内饲养及形态学观察鉴定

成虫的饲养：将采集到的杨树萤叶甲成虫放在有通气孔的小罐中，在罐中放入少量柳树叶片,并放置在室温(20~30℃)下，并保证光照充足。幼虫的饲养：当一龄幼虫孵出后，开始在培养皿中饲养，同样放置在室温下，保证湿度合适。

在饲养的过程中挑出一部分幼虫分龄期保存。放置于-20℃的冰箱中冻存，以备后续实验用。如果需要长期保存可将其放入无水乙醇中保存或者放入超低温冰箱中冻存。

1.2.2 杨树萤叶甲基因组DNA的提取

实验前的材料处理。取无水乙醇中浸泡的杨树萤叶甲的成虫，先用蒸馏水进行冲洗，去除残留的酒精，再将其用剪刀剪成小块，液氮研磨。杨树萤叶甲的幼虫同样先用蒸馏水冲洗，去除残留酒精，再将幼虫切成小块。新鲜材料可直接用液氮研磨处理。利用通用型柱式基因组提取试剂盒(康维世纪)，按照说明书的操作步骤进行提取。

1.2.3 PCR扩增产物

分别取杨树萤叶甲成虫和三龄幼虫的DNA。如果DNA浓度过高,在用之前可先稀释，再作为模板。COI通用引物的序列[13-15]：

LCO1490 5’

—GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG—3’

HCO2198 5’

—TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA—3’

由公司合成引物(北京鼎国公司)，利用PCR仪(PCR仪2400PE，美国)进行PCR扩增。PCR扩增体系为：ddH2O，11 L；10×PCR Buffer ，2 L；MgCl2，2 L；模板，1.5 L；dNTP，2 L；Taq酶(5U/L)，0.5 L；上下游引物各0.5 L。共计20 L。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；52℃退火 50 s；72℃延伸 30 s；循环30次；最后72℃保留10 min。PCR反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物扩增情况。

1.2.4 序列处理

将PCR扩增的产物交由公司测序，测序完成后对序列进行处理分析。使用DNAMAN进行核苷酸序列的分析，用BLAST软件( http://www．ncbi．nlm．nih．gov /blast)进行核苷酸序列的同源性分析。

2 结果与分析

2.1　结杨树萤叶甲的形态学鉴定

杨树萤叶甲成虫为椭圆形，具蓝色金属光泽，体长7.0~8.0 mm。该虫属于完全变态昆虫，分为卵、幼虫、蛹、成虫四个阶段。其中，幼虫又有三个龄期(一龄，二龄，三龄)。图1

注：A.卵； B.幼虫； C.蛹； D.成虫

Note:A. egg B. larvae C. pupa D. adult

图1 杨树萤叶甲的各龄期形态
Fig.1Life cycle ofAgelasticaalniorientalisBaly

2.2　 杨树萤叶甲基因组DNA的提取结果

利用试剂盒所提取的基因组DNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，所得的DNA条带完整，清晰无蛋白质和RNA的污染。电泳图可知：杨树萤叶甲成虫和幼虫分子量大小均为15 000 bp。图2

M:15 000 bp ladder；1,2：幼虫；3：成虫

M: 15，000 bp ladder;1,2: larvae;3：adult

图2 杨树萤叶甲总DNA提取
Fig.2Total DNA fromAgelasticaalniorientalisBaly

2.3　 CO I基因PCR扩增后的电泳结果

将稀释了50倍的杨树萤叶甲成虫和幼虫的基因组DNA作为模板，利用通用引物对其扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，杨树萤叶甲COI基因序列分子量为700 bp左右，与预期结果一致。图3

注：1,2,3:幼虫;4,5:成虫； 6:阴性对照； M:2 000 bp ladder

Note:1, 2, 3: larvae;4,5: adult;6: negative control; M: 2，000 bp ladder

图3杨树萤叶甲COⅠ基因PCR产物电泳图
Fig.3Electrophoresis ofCOⅠ gene PCR productsofAgelasticaalniorientalisBaly

2.4 　PCR测序结果

将通用引物扩增出来的杨树萤叶甲成虫和三龄幼虫的PCR产物直接送公司测序，所得的测序结果如下。

杨树萤叶甲的三龄幼虫序列：

AGGGCGGCCATTCTTATTTTTGGTATTTGAGCAGGATAGTAGGAACATCATTAAGAATTC

TAATTCGAGTAGAATTAGGAAATCCTGGCTCATTAATTGGTAATGACCAAATTTACAATG

TAATCGTAACAGCTCATGCTTTTATCATAATTTTCTTTATAGTTATACCTATCATAATTGGA

GGATTTGGTAATTGACTTGTCCCATTAATAATTGGAGCTCCAGATATAGCATTTCCACGA

ATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCCCCATCAATTTTTTTATTAATTATAAGTAGAAT

TGTAGAAAGAGGAGCAGGGACGGGATGAACAGTATATCCTCCTTTATCTTCTAATATCG

CTCATAATGGTTCATCAGTTGATTTAGCTATTTTTAGCCTTCATTTAGCTGGAATTTCATC

TATTTTAGGTGCCATTAATTTTATTACAACAGTTATTAATATACGACCAAATGGAATAAGA

TTTGACCGAATACCCTTATTTGTCTGAGCAGTAGTAATTACTGCAGTTCTATTATTACTAT

CTTTACCAGTTTTAGCTGGTGCTATTACAATATTATTAACTGACCGAAATTTAAATACATC

ATTTTTTGATCCAACTGGTGGAGGTGACCCAATTCTATACCAACACTTATTT

杨树萤叶甲的成虫序列:

TTACAGAGAGGCTTTACTTTATTTTTGGTTTTGAGCAGGAATAGTAGGAACATCATTAA

GAATTCTAATTCGAGTAGAATTAGGAAATCCTGGCTCATTAATTGGTAATGACCAAATTT

ACAATGTAATCGTAACAGCTCATGCTTTTATCATAATTTTCTTTATAGTTATACCTATCATA

ATTGGAGGATTTGGTAATTGACTTGTCCCATTAATAATTGGAGCTCCAGATATAGCATTT

CCACGAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCCCCATCAATTTTTTTATTAATTATAAG

TAGAATTGTAGAAAGAGGAGCAGGGACGGGATGAACAGTATATCCTCCTTTATCTTCTA

ATATCGCTCATAATGGTTCATCAGTTGATTTAGCTATTTTTAGCCTTCATTTAGCTGGAAT

TTCATCTATTTTAGGTGCCATTAATTTTATTACAACAGTTATTAATATACGACCAAATGGA

ATAAGATTTGACCGAATACCCTTATTTGTCTGAGCAGTAGTAATTACTGCAGTTCTATTAT

TACTATCTTTACCAGTTTTAGCTGGTGCTATTACAATATTATTAACTGACCGAAATTTAAA

TACATCATTTTTTGATCCAACTGGTGGAGGTGACCCAATTCTATACCAACACTTATTT

2.5 　杨树萤叶甲基因组的序列

将杨树萤叶甲成虫与三龄幼虫的序列做初步的比对。又利用NCBI 中的“BLAST”软件进行检索，发现研究所获得的基因序列的同源性很高，证明所获得基因序列真实可信。之后在GenBank中注册了该昆虫的基因序列，登录号为KP250652，可以利用此登录号查找出基因序列。将杨树萤叶甲的成虫和三龄幼虫的测序结果利用DNAMAN软件进行分析，结果显示相似性最高可达97.74%。杨树萤叶甲成虫和三龄幼虫的碱基变化，利用DNAMAN进行序列分析，输出多序列对比的结果所示，相比而言，杨树萤叶甲三龄幼虫的核苷酸序列中存在5个碱基(第1,2,3,4和41位点)的缺失(用·表示)；第7个位点,第9个位点，第13个位点,第14个位点，第16个位点，第20个位点和第21个位点的碱基出现不同。图4

3 讨 论

DNA barcoding提出后就存在许多争议。目前主要集中在以下两个方面:一是DNA barcoding技术与传统分类学的关系；二是关于DNA barcoding的一些技术问题。随着DNA条形码技术研究的不断推进，DNA条形码技术有巨大的潜力能够广泛的进行科学应用,在保护生物学,包括生物多样性调查等领域尤其显著。当传统的分类学受到阻碍时,这种技术就更可以发挥其优势。另外，利用DNA条形码技术为分类学家发现新种提供了一个新方法[16]。

目前，由于杨树萤叶甲在我国分布有局限性，研究的还比较少，在文献中关于杨树萤叶甲DNA条形码的报道也几乎没有，而在新疆杨树萤叶甲对林果业的危害很大，DNA条形码的研究是很有必要的，也具有一定的创新性和研究价值。如果条形码可以在鉴定和检验上得到充分的利用，就会为新疆林果业害虫的防治带来新的生机。因此，利用分子生物学的方法对杨树萤叶甲分类和鉴定，且有快速有效，不受龄期限制的特点，可用于杨树萤叶甲的准确快速鉴定。其中存在的问题有:(1)取材:材料主要依赖野外采集，而且昆虫发生期间时间集中、短暂，很大程度上受季节的影响；(2)保存： 根据文献，将新鲜的材料保存在无水乙醇中，实际提取过程中，发现杨树萤叶甲总DNA有降解的现象，导致实验结果不甚理想。还可以再继续对杨树萤叶甲的蛹，一龄、二龄幼虫的序列继续测定，再做进一步的序列比对。通过对杨树萤叶甲的成虫和三龄幼虫所提取的总DNA经电泳检测，所得的DNA条带完整，清晰无蛋白质和RNA的污染。由于杨树萤叶甲幼虫在保存过程中方法有些不当，DNA有些降解现象，但纯度足够高不影响后续的实验。PCR扩增后，将稀释了50倍的杨树萤叶甲成虫和幼虫的基因组DNA作为模板，利用通用引物对其扩增，其分子量大小与预期大小基本一致。说明PCR体系也很好的满足实验要求，可以进行后续的产物测序。测序完成后，获得了杨树萤叶甲的成虫和三龄幼虫的COI基因序列。

杨树萤叶甲属于完全变态昆虫，其幼虫有三个龄期，而通过幼虫的形态学观察无法断定其种类，DNA条形码就可以快速准确的鉴定出来此幼虫是否为杨树萤叶甲。若鉴定出来，就可以采取合理的方法来进行有效的防治。随着DNA条形码技术的不断发展，可以弥补传统的昆虫鉴定方法的不足之处，为简单快速的鉴定昆虫提供了方法。线粒体基因组的获得对于所需的实验材料要求很高，最好是100%酒精浸泡的新鲜标本；对DNA模板质量、PCR的反应条件、实验操作过程及序列的测定都有很高的要求。因此，在对昆虫测序上，利用DNA条形码技术有优点也有缺点，还需要继续更深入的研究。

注：*表示碱基相同,·表示缺失

Note:* expressed the same base, ·expressed the base deletion

图4 杨树萤叶甲三龄幼虫和成虫的COⅠ基因序列对比
Fig.4COⅠ gene sequence comparison between 3rdinstars larvae and adult ofAgelasticaalniorientalisBaly

4 结 论

通过对杨树萤叶甲的成虫和幼虫总DNA的提取，PCR扩增后进行测序，获得了杨树萤叶甲的成虫和幼虫的COI基因的序列。由于成虫和幼虫的序列最高具有97.74%的一致性，可以根据所获得的序列作为一个参考标准。DNA条形码技术的应用如同平时在超市购物，可以通过刷条形码来确定物品种类、价格。现在，COI基因的序列可作为杨树萤叶甲DNA条形码。所获得的杨树萤叶甲的COⅠ基因序列就可以作为该昆虫的条形码，对其各龄期进行快速准确鉴定，为害虫的及时有效防治提供科学依据。

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DNA Barcoding ofAgelasticaalniorientalisBaly

(Coleoptera: Chrysomelidae)

XI Ou-yan, LI Xiao, ZHENG Fei, DUAN Xing-chen, TANG Xiu-li, HU Hong-ying

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Abstract：【Objective】 Angelastica alniorientails Baly is mainly distributed in Xinjiang, and it is harmful to the leaf of willow and apple tree, the most harmful period of this pest to the crops is in its larval phase which is difficult to be identified. DNA barcoding is a new life identification system which can distinguish species rapidly and accurately by analyzing standard short DNA sequences with enough variation.【Method】By extracting the genomic DNA of Angelastica alniorientails Baly, the CO I gene was used as universal primers to PCR, and the accurate base sequence was got as the DNA barcoding of Angelastica alniorientails Baly.【Result】This study based on the theory that different instars of Angelastica ainiorientails Baly DNA sequence is always consistent. The CO I gene sequence of Angelastica alniorientails Baly in larva and adult can be obtained by the technology of DNA barcoding, and then analyse the serial.CO I gene sequence comparison between 3rd instars larvae and adult of Agelastica alni orientalis Baly,the results show that the similarity of up to 97.74%.So the sequences obtained can be used for preliminary identification of Agelastica alni orientalis Baaly.【Conclusion】Because this method can identify the species of pest simply, rapidly and accurately, it might be able to provide the primary data for pest prevention in time.

Key words:Agelastica alni orientalis Baly; DNA barcoding; COⅠ; rapid and accurate identification

通讯作者:胡红英(1969-)，女，新疆人，教授，博士，博士生导师，研究方向为昆虫学，(E-mail)hoohyi-69@163.com

作者简介:席欧彦(1990-)，女，河南省硕士研究生，研究方向为生物学，(E-mail)13565801178@163.com

基金项目:国家自然科学基金项目(U1170305);国家大学生创新实训项目(XJU-SRT-13049)

收稿日期：2015-10-08

中图分类号：S188;S433.5

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)02-0309-08

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.02.017