哈萨克马不同发育阶段睾丸组织学研究

何良军，廖秋萍，邓海峰 ，董 红 ，毋状元，田 方，陈静波

(1.石河子大学动物科学院，新疆石河子　832000; 2. 塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔　843300;

3.新疆伊犁州昭苏马场，新疆昭苏　835602;4. 新疆畜牧科学院，乌鲁木齐　830000)



哈萨克马不同发育阶段睾丸组织学研究

何良军1，廖秋萍2，邓海峰3，董 红1，4，毋状元1，田 方1，陈静波4

(1.石河子大学动物科学院，新疆石河子832000; 2. 塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300;

3.新疆伊犁州昭苏马场，新疆昭苏835602;4. 新疆畜牧科学院，乌鲁木齐830000)

摘要：【目的】研究对雄性哈萨克马四个发育阶段，即马驹、周岁马、3岁马和5岁以上马的睾丸组织进行组织学观察与分析，了解不同阶段睾丸组织的特点，为种公马的科学管理和使用提供理论依据。【方法】采用石蜡组织切片制作技术和显微观察的方法。【结果】随着马的发育成熟，马的睾丸组织体积逐渐增大，睾丸组织曲精细管的直径也依次增加。幼驹的睾丸组织尚未发育完全，为睾丸索；周岁马的曲精细管已经形成，但是生殖细胞的发育还不完全。比较3岁马和成年马的睾丸大小以及曲精细管和曲精细管内的生殖细胞的数量，3岁马的睾丸体积接近成年马，但是睾丸的宽度和长度略小于成年马(P<0.05)。3岁马曲精细管的直径和细管内的精子数也略小于成年马，但差异不显著(P>0.05)，精子细胞数目之间也无显著差异(P>0.05)。【结论】新疆哈萨克公马在生产中选择4岁以上的公马做种用合理的。

关键词：哈萨克马；睾丸；组织

0 引 言

【研究意义】作为传统牧马大区，新疆养马、育马历史悠久，马在新疆各少数民族经济与生活中占据重要地位。随着现代马业的兴起，新疆作为传统牧马大区，也利用其马资源优势和马文化优势加入到了现代马产业发展的大军。近年来各级各类马运动、马文化系列活动，在全疆范围内如火如荼开展，成为当地各族群众的节日和盛会，吸引了大量游客，促进了当地经济发展，更推动了新疆特色马文化的普及，催生了关联产业的发展[1]。哈萨克马产于新疆伊犁哈萨克自治州、博尔塔拉蒙古自治州和昌吉回族自治州等地区,是我国养马业的一个重要品种资源,是适合我国国民经济发展需要的一个兼用型地方良种马。哈萨克马是经过劳动人民长期选育而成的，它的形成与游牧交通运输和战争对马匹的需要新疆具有广阔丰茂的草原以及，新疆与中亚优良马种的交流有密切关系[2]。目前哈萨克马匹数量在新疆约占50%，其中伊犁地区绝大多数哈萨克马已被引入马杂交，因此该地区纯种哈萨克马数量逐年减少。同时最近几年随新疆地区马肉消费量的增加，加速了哈萨克马数量的减少，作为珍贵的地方马品种资源，应予以保护[3]。【前人研究进展】繁殖力是指动物维持正常生殖机能、繁殖后代的能力，是评定种用动物生产力的主要指标。繁殖力是个综合性状，涉及动物生殖活动各个环节的机能。对公畜来说，繁殖力反映性成熟早晚、性欲强弱、交配能力、精液质量和数量等，而这些都与睾丸的发育直接相关，所以睾丸发育的程度和健康状况是至关重要的。睾丸发育的状况 直接影响到动物的繁殖性能，并且睾丸组织学水平的研究可全面反映其结构与功能的变化规律[4]。因此，对动物睾丸组织结构的观察尤其重要。人、小鼠、猪、牛、羊、鸡、猫、貉等多种哺乳动物或家禽睾丸组织已有过相关基础研究，甚至到分子水平[5]。在睾丸发育过程中，大多数哺乳动物精子发生启动位置在睾丸中是随机的，马的睾丸与其它哺乳动物不同，马精子发生的启动位置是固定的，在睾丸实质的中间部分，睾丸组织颜色的变化与精子发生是相关的[6]。有研究将马胎儿、1.5岁马、2岁马、5岁马睾丸深色区和浅色区相比较，主要测定曲精细管大小、细胞组成、在睾丸中比例及每克睾丸组织中初级精母细胞的数量。该研究认为马睾丸实质颜色的变化与曲精细管发育的差异是对应的，马的睾丸是理想的模型，用于研究细胞因子变化如何影响局部精子的启动[7]。 【本研究切入点】国内近年还未见对不同发育阶段马睾丸组织学研究的报道。研究对马四个发育阶，即马驹、周岁马、3和5岁以上的马的睾丸组织进行组织学观察与分析，为提高哈萨克马的繁殖性能和科学养殖提供理论依据。【拟解决的关键问题】研究采用常规的石蜡切片技术制片，通过比较睾丸大小、内部组织发育情况等，观察哈萨克马不同发育阶段公马睾丸组织结构特点，为该品种马的资源保护与利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1　材 料

样品均来自哈萨克马主产区伊犁地区。3岁以上马在伊宁市某马屠宰场采集，屠宰场马年龄根据牙齿的生长和磨损来判断[8]。共采集到马驹(5月龄)3匹；周岁马(1.5岁)3匹；3岁马3匹；5~10岁马20匹共计54个睾丸组织样品。

1.2　方 法

1.2.1取材与固定

所有马匹屠宰后，将睾丸从阴囊内取出之后，首先测量2个睾丸的长度和周长，记录马的年龄、编号和每个睾丸大小的数据。然后取2~3 cm3大小的睾丸组织2块，用纱布包裹并附加标签，在10%甲醛溶液中浸泡24 h后，再投入波恩氏液中。

1.2.2切片制作

采用常规的石蜡包埋、H.E染色或卡红染色技术制备切片，切片厚度为5 μm，选择连续10片制片。

1.2.3显微观察与测量

显微观察睾丸组织曲精细管，每个睾丸切片挑选30个正圆或接近正圆形的曲精细管，测量其直径，并计数管腔内各类细胞(精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞)的数目。

1.3　数据统计

所有数据用SPSS 10.0S生统软件进行统计，t检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1　结不同年龄马睾丸大小

马驹到成年马的发育过程中，睾丸也逐渐变大，睾丸长度由3 cm增大到9.5 cm，睾丸宽度由1.4 cm增大到6.3 cm。表1

表 1不同年龄马牙齿生长、睾丸组织大小和曲精细管显微观察结果
Table 1 Horse teeth eruption, testis size and seminiferous tubules

年龄Age齿的生长Teetheruption睾丸长(cm)Testislength睾丸宽(cm)Testiswidth曲精细管/睾丸索直径(μm)Seminiferoustubule/testicularcorddiameter精子细胞数(N)No.roundspermatids长形精子细胞数(N)No.elongatedspermatids5月龄马驹5-month-oldfoal乳门齿和乳中间齿3±0.11.4±0.12.2±0.2001-2岁(周岁马)1.5-year-oldyearling乳门齿、乳中间齿和乳隅齿4.5±0.72.6±0.36.1±0.3003岁3-year-oldstallion永久中间齿乳中间齿、乳隅齿7.6±0.74.4±0.48.5±0.647.9±28.826.7±8.95岁以上(成年)Aged5yearsormorestallion切齿均为永久齿9.5±0.96.3±0.69.1±0.475.8±29.242.2±11.2

注：N代表平均值

在马驹、周岁马、3岁马、成年马的发育过程中，马的睾丸体积依次增大，睾丸内的曲精细管的直径也随之增加。比较3岁马和成年马的睾丸大小，曲精细管和曲精细管内的生殖细胞的数量，结果表明，3岁马的睾丸明显小于成年马，但是睾丸的宽度和长度小于成年马(P<0.05)。3岁马曲精细管的直径和细管内的精子数也略小于成年马，差异不显著(P>0.05)，但是精子细胞数之间没有显著差异(P>0.05)。表1

注：5月龄马驹睾丸组织切片中可见许多的睾丸索，各睾丸索之间有大量间质细胞，箭头所指为睾丸索

Note:5-month-old foal testicular section demonstrating presence of testicular cords surrounded by numerous interstitial cells

图1 5月龄马驹睾丸组织切片(H.E 20×)
Fig. 1 5-month-old foal testis histology section

2.2　 不同发育阶段睾丸组织结构特点

2.2.1幼公驹睾丸组织结构

5月龄马驹睾丸组织切片中可见许多的睾丸索(testicular cord)，各睾丸索之间有大量间质细胞。睾丸索管腔内含有精原细胞、支持细胞和少量的精母细胞，精原细胞紧靠睾丸索基膜，精母细胞位于管腔中央，支持细胞位于周围，睾丸索没有空腔形成。睾丸索直径范围2~3 μm，平均为2.2 μm。表1，图1，图2

2.2.2周岁公马睾丸组织结构

1.5岁马睾丸组织切片中可见有许多的曲精细管存在，曲精细管密度明显增大，管腔直径变化大，管腔中细胞层次较少，间质组织增多。管腔内含有精原细胞，可见精母细胞，或含有多种精母细胞，管腔内有多个空泡连成片，曲精细管直径范围5~7 μm，平均为6.1 μm。表1，图3，图4

注：5月龄马驹睾丸睾丸索，可见精原细胞、精母细胞和支持细胞，精原细胞位于基底(下面的箭头)，精母细胞在管腔中央(上面的箭头)，支持细胞位于周围(中间的箭头)

Note:5-month-old foal testicular cords which contains gonocytes in the center and Sertoli cells

图2 5月龄马驹睾丸组织切片(H.E 40×)
Fig. 2 A testicular cord cross-section of 5-month-old foal testis

注：可见有许多的曲精细管存在

Note:the 1.5-year-old yearling testis section demonstrating formation of seminiferous tubules

图31.5岁马睾丸组织切片(H.E 10×)

Fig.3 1.5-year-old foal testis histology section

注：管腔内含有精原细胞，管腔内有多层生殖细胞，箭头所指为生殖细胞

Note:the 1.5-year-old yearling testis section demonstrating formation of seminiferous tubules with multiple layers of germ cells

图41.5岁马睾丸组织切片(H.E 40×)
Fig.4 The seminiferous tubule cross-sections of 1.5-year-old foal

2.2.33岁公马睾丸组织结构

3岁马睾丸组织内曲精细管腔直径也进一步增大接近成年马，管腔中细胞数量增多，生殖细胞种类已经完善。管腔内形成一个完整的空腔，生殖细胞有一层或多层，但与成年马相比较仍显较薄，可以观察到精原细胞，精母细胞、精细胞和精子，曲精细管直径范围8~10 μm，平均为8.5 μm，管腔内平均精子细胞数为47.9个，平均长形精子细胞数为26.7个。表1，图5，图6，

注：3岁马曲精细管腔直径也进一步增大接近成年马，管腔中细胞数量增多，生殖细胞种类已经完善

Note:3-year-old horse seminiferous tubule diameters increase and are slightly smaller than those of adult horses, with much increased germ cells and complete spermatogenesis

图5 3岁马睾丸组织切片(卡红10×)

Fig.5 3-year-old stallion testis histology section

注：3岁马曲精细管腔内可以观察到精原细胞，精母细胞、精细胞和精子，箭头所指管腔中深蓝色细胞为精细胞，管腔中白色区域中可见精子(细胞)

Note:3-year-old horse seminiferous tubule shows presence of spermatogonia, spermatocytes and spermatids

图63岁马睾丸组织切片(H.E 40×)
Fig.6 Seminiferous tubule cross-section of 3-year-old stallion

2.2.4成年公马睾丸组织结构

镜下显示成年马睾丸曲精细管管腔中生殖细胞种类完整，可见精原细胞，精母细胞，圆形精子细胞和长形精子细胞的存在，后2种细胞位于管腔中央，精原细胞位于基底膜上，曲精细管直径范围8~11 μm平均为9.1 μm，管腔内平均精子细胞数为75.8个，平均长形精子细胞数为42.2个。图7，图8，表1

注：7岁马睾丸曲精细管管腔中生殖细胞种类完整，并且有良好的精子发生

Note:7-year-old horse seminiferous tubules have complete and good spermatogenesis

图7 7岁马睾丸组织(卡红10×)

Fig. 7 7-year-old stallion testis histology section

注：可见精原细胞，精母细胞，圆形精子细胞和长形精子细胞的存在

Note:A adult horse seminiferous tubule cross-section shows presence of spermatogonia, spermatocytes and spermatids

图87岁马睾丸组织(卡红40×)
Fig. 87-year-old stallion seminiferous tubule cross-section

统计结果显示，在哈萨克成年公马的曲精细管中，圆形精子细胞和长形精子细胞的数量差异比较大，变化范围分别是16.6~119.2个和18.5~69.0个。当曲精细管内圆形精子细胞和长形精子细胞数量多时，绝大多数曲精细管管腔中间的空腔面积较小，相反则管腔中空腔面积较大。

3岁马的长形精子数为26.7±8.9，5岁以上成年马的长形精子数为42.2±11.2。3岁公马长形精子数与5岁以上成年公马中的最低值相似。显微观察，3岁马曲精细管中的空腔面积与5岁以上成年公马中的最差水平相当。

3 讨 论

3.1　不同年龄公马的睾丸发育情况

公马的繁殖性能受多种因素的影响，这包括年龄、遗传、管理、季节和疾病等。对公马的过度或过早的使用，年轻公马均会造成公马成年后的繁殖性能降低。3岁马的睾丸在体积、曲精细管直径和精子数等方面要小于成年马，这时公马的睾丸大小和机能需要进一步发育和完善。因此，1.5~3岁是马生长发育和性腺发育的关键时期，故在这一段时期内，要加强饲养管理，以确保该公马的发育良好。待睾丸发育完善后，繁殖性能可在长时间内保持较高的水平。如果公马在睾丸发育不完全时过度利用，会影响今后的使用年限，降低公马的繁殖潜力。有研究显示，马到4岁时睾丸的重量、产精量和生殖细胞的数目均达到成年公马水平[10]，虽然研究没有获得4岁公马的睾丸组织，但证实了3岁马睾丸组织尚待进一步发育，其发育程度尚未达到成年马。在新疆哈萨克族牧民选择4岁以上的公马用于配种，这种配种年龄的选择与研究结果是一致的。

3.2　马睾丸组织学观察

出生时，公马驹睾丸内仅有未分化的支持细胞和生殖母细胞[6]。在公马睾丸从未成熟向成熟发育的过程中，睾丸的中心部位开始颜色变浅，睾丸组织正在经历向形成曲精细管的方向转变，开始进行精子发生。当公马达到性成熟时，曲精细管完全形成，开始精子发生[6]。当睾丸实质的颜色由深红色变成浅色时，生殖母细胞转变为精原细胞，此时，睾丸内的细胞凋亡会出现一个暂时的高峰，这有利于曲精细管的形成与成熟[11]。研究中5月龄的马驹睾丸呈深褐色，1.5岁周岁马的睾丸呈浅褐色，3岁马的睾丸呈肉粉色。雄性动物在从幼年期到青春期之间还有一个过渡时期，被称为初情期。当马开始射精，且精液中精子总数大于5×107个，精子活力达到10%或以上，就意味着公马进入性成熟期[12]。从这个定义可以看出，公马在达到青春期前已产生精子，只是精子数量较少，活力也较低。研究结果显示，1.5岁马的睾丸正在发育，体积正在增大，管腔直径变大，管腔内生殖细胞处于增生、分化状态，但生殖细胞种类还不全面，尚缺少圆形精子细胞和长形精子细胞，因此，1.5岁的哈萨克马尚处于初情期，3岁马的睾丸大小、曲精细管直径及管内圆形精子细胞和长形精子细胞的数量接近成年马。有研究认为，曲精细管中长形精子数量的平均值与该雄性动物精液中精子的总数呈强正相关[13]。所以，可以推测，3岁马一次射精精液中精子总数要低于5岁以上成年公马的平均水平。

哺乳动物的精子发生是一个复杂的细胞分化过程，其依赖于一个真正的干细胞群体，它们具有自我更新和产生后代分化为精子的能力。生精细胞起源于原始生殖细胞，在生精索时其形态学就发生了改变，演变成为生精母细胞，而后发育成精原细胞，数次有丝分裂后，转变为初级精母细胞。初级精母细胞通过减数分裂生成单倍体的圆形精子细胞。圆形精子细胞通过一系列复杂的形态变化，发育为具有头、颈、尾结构的精子。精子发生按其顺序，大致包括三个阶段:第一阶段从是精原干细胞经有丝分裂、分化发育形成初级精母细胞;第二阶段是初级精母细胞经减数分裂 I形成次级精母细胞，再经减数分裂 II 形成单倍体精子细胞;第三阶段是精子细胞变形，包括顶体发生、核浓缩拉长、尾形成，多余胞质脱落，形成高度分化的精子。由于这个时期细胞核浓缩拉长，所以被称为长形精子(elongated spermatid)。

研究中，5月龄哈萨克马睾丸曲精细管中只有支持细胞和原始生精细胞；1.5岁时曲精细管中出现精母细胞，精子发生完成第一阶段。3岁时，曲精细管中出现次级精母细胞及圆形精子细胞，说明精子发生已完成第二阶段。3岁时观察到圆形精子细胞出现细胞核的变形、伸长，且在管腔中开始有精子的出现，此后各期管腔中精子均稳定出现，这意味着马生精上皮真正成熟的时期是生后3岁以上，而不是精子首先出现的 3岁。以上研究结果表明：哈萨克公马生精细胞的发育从出生就已开始，经过一个连续的发育分化过程， 约在3岁后发育成熟。

4结 论

新疆哈萨克马雄性幼驹的曲精细管尚未发育完整，为睾丸索，周岁马的曲精细管已经形成，但是生殖细胞发育还不完全，睾丸间质细胞数量多。3岁公马生殖细胞种类完整，但精子细胞和精子数量较少；5~12岁马生殖细胞种类完全，精子细胞和精子数目较多。哈萨克公马在4岁后可用于繁殖生产。

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Histological Differences in Kazakh Horse Testes at

Different Development Stages

HE Liang-jun1, LIAO Qiu-ping2, DENG Hai-feng3, DONG Hong1，4，

WU Zhuang-yuan1, TIAN Fang1, CHEN Jing-bo4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832003,China; 2.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,AlarXinjiang843300,China; 3.ZhaosuHorseStud-Farm,YiliKazakAutonomousPrefecture,ZhaosuXinjiang835602,China; 4.XinjiangAcademyofAnimalSciences，Urumqi830000,China)

Abstract：【Objective】 The present study aims to analyze the histological sections of Kazakh horse testes at different development stages: 5-month-old foal, 1.5-year-old yearling, 3-year-old stallion and stallion aged 5 years or more. The aim of the study is to identify distinct histological characteristics at different testicular development stages with an eye to provide scientific reference for stallion feeding and management.【Method】The main methods employed in the study were paraffin section technique and microscopic observation.【Result】 Horse testis size and seminiferous tubule diameter increased with age. Testicular cords were found in foal testes and were of primary form of seminiferous tubule. Yearlings had under-developed testes, with appearance of seminiferous tubules, incomplete germ cells of spermatogenesis. 3 years horse had complete germ cells of spermatogenesis, with smaller testis size (P<0.05), smaller seminiferous tubule diameters (P>0.05) and less elongated spermatids (P>0.05) than stallions aged 5 years or older.【Conclusion】Based on the above findings, it is scientific to utilize stallions aged 4 years or older to mate mares.

Key words:Kazakh horse; testis; tissue

通讯作者:陈静波(1956-)，男，四川人，研究员，博士生导师，研究方向为动物生物技术，(E -mail) chenjb126@126. com

作者简介:何良军(1974-)，男，湖北人，博士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖，(E-mail)wsw_sunny@aliyun.com

基金项目:速步、乳用、耐力马新品种(系)培育及良种扩繁技术研究与集成示范课题"马高效快繁关键共性技术研究与示范" ；自治区马产业重大专项"马(运动、肉用、乳用)生产关键技术研究与示范"课题二"肉用马新类型培育与生产关键技术研究与示范" (201130101-2)

收稿日期：2015-07-08

中图分类号：S813 ；S821

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)02-0376-07

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.02.026