豆豉纤溶酶研究进展

刘　雪济南市食品药品检验检测中心，山东济南　250000



豆豉纤溶酶研究进展

刘雪
济南市食品药品检验检测中心，山东济南250000

摘要豆豉纤溶酶（Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE）是豆豉中的发现的一种新型纤溶酶，在体外具有良好的溶栓作用。本文综述了豆豉纤溶酶的溶栓机理、产生菌的筛选、酶学特性及基因的克隆表达等方面的进展，为进一步研究指明了方向。

关键词豆豉纤溶酶；酶学性质；克隆表达

近年来血栓性疾病日益成为高发态势，为人类健康带来严重威胁，据统计，我国心脏病及脑中风的死亡率超过60%，而药物溶栓是目前临床最有效、应用最广的治疗手段。

日本学者须见洋行最早从纳豆中提取到能溶解纤维蛋白的纳豆激酶（NK），我国豆豉与日本纳豆生产工艺相似，近年我国学者从豆豉中分离出产纤溶酶的枯草杆菌，将其所产纤溶酶命名为豆豉纤溶酶[1]（DFE），并对DFE的生产菌株、酶学性质、溶栓机制以及分子克隆表达等进行了研究[2]。

1　豆豉纤溶酶来源

豆豉纤溶酶主要来源于豆类发酵制品中的细菌，目前筛选出产DFE的菌株，主要有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌。1997年傅莉最早筛选到产纤溶酶活达200U/mL的枯草芽孢杆菌；之后多位学者筛选出产DFE活力较高的菌株，董明盛从豆豉中分离到DFE活性达683.3U/mL的枯草芽孢杆菌，魏静分离到产纤溶酶活达452U/mL的凝结芽孢杆菌，彭勇等从豆豉中筛选到具有较高纤溶酶活的解淀粉芽孢杆菌，发酵液纤溶酶活力可达820U/mL。

2　豆豉纤溶酶溶栓机制

对DFE溶栓机制的研究，由于菌株来源不同，目前研究结果不尽相同，还有待进一步研究。研究方法为：同时在未处理和80℃热处理过的纤维蛋白板上滴加酶液，检测纤溶情况。若未加热的板与加热板的纤溶程度相同，显示的仅是纤溶活性的作用，若未加热的板纤溶程度高于加热板，显示存在纤溶活性和纤溶酶原激活活性两种作用。王金英等研究了豆豉粗酶液，发现其同时存在直接纤溶和间接激活纤溶酶原活性两种作用；彭勇等对解淀粉芽孢杆菌DC-4、刘柱对Bacillus sp. Nov及牛术敏等对枯草芽孢杆菌BS-26产的DFE的研究结果基本一致，在两种纤维蛋白平板上的纤溶结果无明显差异，显示其仅是直接溶解纤维蛋白；通过动物血栓模型王成涛[3]对枯草杆菌 DC12-33发酵液中纯化的纤溶酶的纤溶机制进行研究，结果酶对80℃加热处理血凝块的水解明显慢于未经加热组，说明它同时存在直接水解和激活纤溶酶原两种纤溶机制。

3　豆豉纤溶酶性质

豆豉纤溶酶常通过磷酸钙吸附、离子交换分离、丙酮沉淀、超滤脱盐和凝胶过滤等方式进行纯化和性质检测。研究发现DFE是一种丝氨酸蛋白酶，pI为8～9，酶蛋白分子量为27kD～36kD，豆豉来源不同分子量有一定差异。彭勇通过SDS-PAGE检测解淀粉芽孢杆菌DC-4产生的纤溶酶，发现无论上样缓冲液中是否存在β-巯基乙醇，均呈现一条电泳条带，证明豆豉纤溶酶为单链蛋白。

豆豉纤溶酶的热稳定性和酸稳定性较弱，阎家麒等发现DFE在pH7～11范围内稳定，而pH＜5时很快失活，但冻融对酶活性影响较小，-18℃反复冻融5次，酶活性损失小于5%。米坤研究了地衣芽孢杆菌产生的纤溶酶，分别在人工胃液和人工肠液中37℃放置3h，结果在人工胃液中残余酶活约仅为17.6%，而在人工肠液中残余酶活高于70%，应用中宜将其制成肠溶剂以保持其较高活力。为提高稳定性张婵等采用硫酸铵梯度法制备了DFE纳米脂质体，减少了在胃肠内的降解，为解决DFE口服生物利用度低等问题提供了新途径。

4　豆豉纤溶酶基因工程改造

目前产纤溶酶的天然菌株普遍产酶量较低，为提高其产量，近年我国学者利用基因工程菌生产DFE，目前初步表达出活性DFE。最早彭勇[4]从解淀粉芽孢杆菌DC-4基因组中克隆到DFE成熟肽基因，将其构建成融合型表达载体pET-Nde，转化大肠杆菌，诱导表达出无活性的包涵体融合蛋白。罗文华研究了基因自身启动子的作用，扩增获得DFE启动子至3p非翻译区的全长1400bp基因，通过大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3，转化到枯草杆菌WB800，加入自身启动子后，重组菌获得了高活性分泌表达，酶活高达690U/mL。王开敏等[5]对从豆豉的强纤溶活性的菌株扩增DFE基因，构建pYES2-DFE重组质粒，导入到酿酒酵母感受态细胞中，诱导表达后DFE活性达222.49U/mL，使DFE基因在真核生物中高活力的分泌表达。崔堂兵等采用定向进化技术对DFE基因进行定点突变，将第156位的谷氨酸、第166位的甘氨酸分别替换为丝氨酸和丙氨酸，第169位甘氨酸残基替换为丙氨酸，并利用枯草芽孢杆菌WB800构建了表达菌株，3种表达菌株发酵上清液中纤溶酶的

活力性分别是原菌株活力的70%、115%和136%，为提高酶活力提供了一个新的有效途径。

5　结论

依据目前研究成果，纤溶酶的活力产量难以应用与实际生产需要，通过诱变育种、优化发酵条件、基因工程技术等多种方式进一步提高酶活及产量变得非常关键。虽纤溶酶体外溶栓效果得到证实，但在体内的溶栓效果、毒副作用、最佳给药方式等，还需要更进一步研究，也是DFE真正投入到临床及市场前必须进行研究的重点。

参考文献

[1]韩秋霞，邹玉红，崔志芳.一株高活性豆豉纤溶酶产生菌的筛选及其酶活的测定[J].中国酿造，2008，10：28-31.

[2]Shi H.Wang，Cheng Zhang， etal. Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547[J]. World J Microbiol Biotechnol ，2008，24:475–482.

[3]王成涛，郑杰，籍保平，等.豆豉纤溶酶Subtilisin FS33的溶栓作用及其机制的研究[J].营养学报，2007，29 （6）：600-604.

[4]彭勇，黄庆，张义正.枯草杆菌DC-2纳豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达[J].中国生物化学与分子生物学报，2002，18（5）：559-563.

[5]王开敏，赵敏.产纤溶酶菌株的分离和鉴定及纤溶酶基因在酿酒酵母中的表达[J].中国食品学报，2009，9（2）：23-28.

中图分类号TS201.2

文献标识码A

文章编号1674-6708（2016）155-0143-01