苦参碱对人膀胱癌BIU-87/ADM细胞多药耐药的影响

左陵君，张耘新，段建敏兰州大学第二医院泌尿外科，甘肃 兰州 730030



苦参碱对人膀胱癌BIU-87/ADM细胞多药耐药的影响

左陵君，张耘新，段建敏
兰州大学第二医院泌尿外科，甘肃 兰州 730030

摘要：目的探讨苦参碱对人膀胱癌BIU-87/ADM细胞多药耐药逆转作用的机制。方法MTT法检测细胞生长抑制率；荧光分光光度计检测阿霉素（ADM）的蓄积和外排；免疫印迹法检测P-糖蛋白（P-gp）表达；P-gp-GloTMAssay System试剂盒检测P-gp ATP酶活性。结果经ADM作用后，与敏感细胞株BIU-87存活率比较，耐药细胞株BIU-87/ADM存活率明显增加（P＜0.001），苦参碱呈剂量依赖地降低BIU-87/ADM细胞存活率（P＜0.01），而对敏感细胞株BIU-87细胞存活率无显著影响。苦参碱呈剂量依赖地增加ADM在BIU-87/ADM细胞中蓄积水平，抑制ADM细胞内外排。苦参碱明显抑制P-gp蛋白表达，降低P-gp ATP酶活性。结论苦参碱通过抑制BIU-87/ADM细胞P-gp蛋白和ATP酶活性，减弱P-gp外排功能，增加细胞内ADM蓄积，从而发挥对人膀胱癌BIU-87/ADM细胞多药耐药的逆转作用。

关键词：苦参碱；BIU-87/ADM细胞；多药耐药；逆转

肿瘤细胞的多药耐药（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤化疗失败主要原因之一。目前研究表明，细胞膜上P-糖蛋白（P-gp）的过度表达及P-gp ATP酶活性升高是肿瘤细胞产生MDR的主要机制[1-2]。苦参碱作为苦参的主要活性成分，具有明显的化疗增敏作用，目前已广泛用于肿瘤的辅助治疗[3-6]，但对人膀胱癌阿霉素（ADM）耐药是否具有逆转作用，目前尚不清楚。本实验拟探讨苦参碱对人膀胱癌BIU-87/ADM耐药细胞的逆转作用及其机制，以期为其临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1细胞

人膀胱癌BIU-87细胞及BIU-87/ADM耐药细胞由四川大学华西医院泌尿外科赠送，兰州大学第二医院泌尿外科研究所保藏。

1.2主要试剂与仪器

RPMI1640培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司），胎牛血清、MTT（美国Sigma公司），RIPA裂解液、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），P-gp抗体、β-actin抗体（美国SantaCruz公司），HRP偶联羊抗鼠二抗（北京中杉金桥公司），P-gp-GloTMAssay System试剂检测盒（美国Promega公司）；CO2培养箱、全波长Multiskan Spectrum酶标仪（美国Thermo公司），荧光光度计（RF-5301PC，日本岛津）。

1.3药物

苦参碱注射液，山西振东泰盛制药有限公司，批号130120；注射用盐酸多柔比星，山西普德药业有限公司，批号1211-1。

1.4细胞存活率检测

取对数生长期人膀胱癌BIU-87细胞及BIU-87/ ADM耐药细胞接种于96孔培养板，培养24 h后加不同浓度苦参碱（0.5、1.0、2.0 µg/mL）和10 µg/mL ADM，对照组在培养体系中加同浓度DMSO。37 ℃、5%CO2培养48 h后弃培养基，各孔加5 mg/mL MTT 20 µL，继续孵育4 h。弃培养基，每孔加DMSO 200 µL，待溶解显色后于酶标仪570 nm波长处测定OD值，计算细胞存活率（实验组平均OD值÷对照组平均OD值×100%）。所有实验均重复3次。

1.5阿霉素蓄积检测

参考文献[2，7]方法，通过检测ADM自发荧光强度反映ADM的蓄积程度。收集1×106BIU-87/ADM细胞，与不同浓度苦参碱或DMSO于37 ℃孵育1 h 加10 µg/mL ADM孵育3 h。冷PBS洗涤细胞3次后，重悬收集细胞，荧光光度计检测分析相同数目细胞的荧光强度，激发波长480 nm，发射波长570 nm，并计算相对荧光强度值。

1.6阿霉素外排检测

加含10 µg/mL ADM的培养液与细胞孵育3 h后，弃培养基。加不同浓度苦参碱或DMSO培养液后，继续孵育1 h。冷PBS洗涤3次后，重悬收集细胞，荧光光度计检测。

1.7Western blot检测

按“1.4”项处理细胞24 h后收集细胞，PBS洗涤加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA细胞裂解液提取总蛋白。Bradford法蛋白定量，上样量30 µg，10%SDS-PAGE进行电泳2.5 h。PVDF膜转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜；1×TBST洗涤3×10 min。二抗（1∶2000稀释）37 ℃孵育2 h，1×TBST洗涤3×10 min。ECL显色法进行检测。采用软件Image pro plus 6.0比较条带的积分光密度。

1.8P-糖蛋白ATP酶检测

严格按P-gp-GloTMAssay System试剂盒使用说明书进行检测。

1.9统计学方法

采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，组间比较采用方差分析，组间均数多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1苦参碱逆转BIU-87/ADM细胞对阿霉素耐药性的影响

经ADM作用后，与敏感细胞株BIU-87存活率比较，耐药细胞株BIU-87/ADM存活率明显增加（P＜0.001），即BIU-87/ADM细胞对ADM表现出明显的耐药性。预实验结果显示，苦参碱单独作用于BIU-87/ADM细胞的IC50为32.5 µg/mL，本实验选取对BIU-87/ADM细胞无明显细胞毒作用的剂量0.5，1.0、2.0 µg/mL。结果显示，苦参碱呈剂量依赖地降低BIU-87/ADM细胞存活率，即有效地逆转BIU-87/ADM细胞对ADM的耐药性，而对敏感细胞株BIU-87细胞存活率无显著影响，见表1。

表1　各组细胞存活率比较（±s，%）

表1　各组细胞存活率比较（±s，%）

注：与同组BIU-87比较，###P＜0.001；与ADM组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001（下同）

组别　n　BIU-87　BIU-87/ADM对照组　3　100　100 ADM组　3　42.7±10.1　87.1±13.3###ADM＋苦参碱0.5 µg/mL组　3　42.6± 9.2　70.6±13.4*ADM＋苦参碱1.0 µg/mL组　3　42.5± 8.9　65.7± 9.7**ADM＋苦参碱2.0 µg/mL组　3　43.1±11.4　57.5±12.7***

2.2苦参碱对阿霉素BIU-87/ADM细胞内蓄积的影响

预先未加苦参碱，单纯ADM作用后，BIU-87/ ADM细胞内ADM的荧光强度较弱，即ADM蓄积水平较低。苦参碱呈剂量依赖地增加ADM在BIU-87/ADM细胞中蓄积水平，见表2。

表2　各组BIU-87/ADM细胞ADM蓄积水平比较（±s）

表2　各组BIU-87/ADM细胞ADM蓄积水平比较（±s）

组别　n　相对荧光强度值ADM组　3　　1.00±0.00 ADM＋苦参碱0.5 µg/mL组　3　　1.61±0.21*ADM＋苦参碱1.0 µg/mL组　3　　1.95±0.52**ADM＋苦参碱2.0 µg/mL组　3　　2.27±0.38***

2.3苦参碱对阿霉素BIU-87/ADM细胞内外排的影响

经ADM孵育BIU-87/ADM细胞3 h后，再加不同浓度苦参碱或DMSO。结果显示，溶剂组BIU-87/ADM细胞内荧光强度较低，即ADM外排较多；苦参碱明显增加细胞内荧光强度，即抑制ADM的外排，见表3。

表3　各组BIU-87/ADM细胞ADM外排水平比较（±s）

表3　各组BIU-87/ADM细胞ADM外排水平比较（±s）

组别　n　相对荧光强度值ADM组　3　　1.00±0.00 ADM＋苦参碱0.5 µg/mL组　3　　1.24±0.32 ADM＋苦参碱1.0 µg/mL组　3　　1.53±0.22*ADM＋苦参碱2.0 µg/mL组　3　　1.63±0.51**

2.4苦参碱对BIU-87/ADM细胞P-糖蛋白表达及其ATP酶活性的影响

苦参碱明显抑制BIU-87/ADM细胞P-gp蛋白表达（见图1），并呈剂量依赖地抑制P-gp ATP酶活性，见表4。

图1　各组BIU-87/ADM细胞P-gp蛋白表达

表4　各组BIU-87/ADM细胞P-gp ATP酶活性比较（±s）

表4　各组BIU-87/ADM细胞P-gp ATP酶活性比较（±s）

3　讨论

人膀胱癌BIU-87/ADM耐药细胞模型是研究膀胱癌多药耐药的最常用模型之一[8]。本研究通过建立该模型评价苦参碱对BIU-87/ADM耐药的逆转作用，结果显示，苦参碱可剂量依赖地逆转BIU-87/ADM细胞对ADM的耐药性。

P-gp具有ATP依赖性“药泵”功能，通过与ATP结合将细胞内药物转移至细胞外，减少药物蓄积，降低细胞内的药物浓度，从而导致细胞产生耐药性。本实验结果显示，苦参碱能显著抑制ADM外排，增加ADM在BIU-87/ADM细胞中蓄积水平，这提示苦参碱对BIU-87/ADM耐药的逆转作用可能与调节P-gp蛋白表达有关。进一步Western blot实验发现，苦参碱呈剂量依赖地抑制P-gp蛋白表达，验证了上述推断，即苦参碱通过抑制P-gp蛋白表达，减少ADM外排，增加ADM在BIU-87/ADM细胞中蓄积水平，从而发挥其对BIU-87/ADM耐药的逆转作用。

一般认为，P-gp药物外排作用与ATP的水解相偶联，所以P-gp底物可诱导ATP酶活性。本研究发现，在BIU-87/ADM耐药细胞株中ADM能明显增加P-gp ATP酶活性，即ADM为P-gp底物，这与前人报道一致[9]。同时，我们发现苦参碱能抑制BIU-87/ADM耐药细胞株中P-gp ATP酶活性。

综上，苦参碱对BIU-87/ADM细胞耐ADM具有较强的逆转作用，其机制是通过抑制P-gp蛋白表达，降低P-gp ATP酶活性，减少P-gp外排作用，从而增加ADM在细胞内的蓄积。

[1] GILLET J P, GOTTESMAN M M. Mechanisms of multidrug resistance in cancer[M]. New Jersey：Humana Press,2010：47-76.

[2] MICHAELIS M, ROTHWEILER F, KLASSERT D, et al. Reversal of P-glycoprotein–mediated multidrug resistance by the murine double minute 2 antagonist nutlin-3[J]. Cancer research,2009, 69(2)：416-421.

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[4] 王磊,李灵招,王晓芳,等.复方苦参注射液联合伽玛刀治疗局部晚期胰腺癌临床研究[J].中国中医药信息杂志,2015,22(6)：21-24.

[5] 魏有刚.复方苦参注射液联合盐酸羟考酮治疗肺癌疼痛疗效观察[J].中国中医药信息杂志,2015,22(10)：28-30.

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[8] 林劲权,周辉良,蔡卫平.mdrl shRNA逆转膀胱癌耐药细胞株BIU-87/ ADM对ADM的耐药性[J].现代泌尿生殖肿瘤杂志,2013,5(6)：356-359. [9] 王磊,柯红,王一羽,等.姜黄素逆转P糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究[J].时珍国医国药,2009,20(3)：101-103.

（修回日期：2015-05-30；编辑：华强）

Effects of Matrine on Multidrug Resistance of Human Bladder Cancer BIU-87/ADM Cells

ZUO Ling-jun, ZHANG Yun-xin, DUAN Jian-min (Department of Urology Surgery, The Second Hospital Affiliated to Lanzhou University, Lanzhou 730030, China)

Abstract:Objective To investigate the reversal mechanism of matrine on multidrug resistance (MDR) in BIU-87/ADM cells. Methods The cell proliferation inhibition rate was detected by MTT assay; the accumulation and efflux of ADM was detected by fluorescence spectrophotometer; the expression of P-gp protein was tested by Western blot; the activity of P-gp ATPase was measured by P-gp-GloTMAssay System kit. Results Compared with the sensitive cell line BIU-87, the survival rate of multidrug resistant cell line BIU-87/ADM was significantly increased after treated with ADM (P<0.001); matrine reduced the survival rate of BIU-87/ADM cells with a manner of dose-dependently (P<0.01), without significant effect on the BIU-87 cell. Matrine increased accumulation of ADM and inhibited P-gp-mediated efflux of ADM. Matrine decreased the expression of P-gp and inhibited the activity of P-gp ATPase significantly. Conclusion Matrine can reverse multidrug resistance in BIU-87/ADM cells by inhibiting the expression of P-gp and ATPase activity, reducing P-gp-mediated efflux of ADM, and increasing accumulation of ADM to play the role in reversal effects on multidrug resistance of human bladder cancer BIU-87/ADM cells.

Key words:matrine; BIU-87/ADM cells; multidrug resistance; reversal

收稿日期：（2015-04-21）

基金项目：甘肃省自然科学研究基金计划（145RJYA256）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1005-5304(2016)02-0073-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.020