基于蛋白质相互作用网络分析右归丸治疗肾阳虚证的疗效机制

谭从娥，黄祥云陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046



基于蛋白质相互作用网络分析右归丸治疗肾阳虚证的疗效机制

谭从娥，黄祥云
陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

摘要：目的建立右归丸治疗肾阳虚证疗效相关的差异蛋白质相互作用网络，探索右归丸治疗肾阳虚证的疗效机制。方法对前期实验取得的蛋白质组数据作进一步数据挖掘。首先筛选肾阳虚证患者经右归丸治疗前后比较的差异表达蛋白，再采用STRING数据库构建差异蛋白质相互作用网络，定位网络中关键蛋白质相互作用关系，并以AmiGO数据库对联系紧密的蛋白质作Gene Ontology（GO）条目富集。结果筛选到7个差异表达蛋白质（P＜0.05）。这7个蛋白质与另外10个预测蛋白质构成的差异蛋白质相互作用网络包含17个节点（蛋白质）、57条边（相互作用关系），其中22个蛋白质相互作用关系的综合置信值＞0.7，其中C3、C5和CFH均为补体系统重要成分，其功能主要与免疫调节有关。结论右归丸对肾阳虚证的调控作用包括补体激活、创伤愈合、体液水平调节等多个方面，其中对补体系统的调节作用可能为右归丸促进肾阳虚证免疫平衡的重要机制之一。

关键词：肾阳虚证；右归丸；蛋白质相互作用网络

肾阳虚证临床主要表现为腰膝酸软、畏寒肢冷、夜尿频多等，治法以温补肾阳为主，临床以右归丸为代表方剂。右归丸出自明代《景岳全书》，由熟地黄、炮附片、肉桂、山药、山萸肉、菟丝子、鹿角胶、枸杞子、当归、杜仲组成，主要功效为温补肾阳、填精益髓，主治肾阳虚证。我们前期采用核素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术，对经右归丸治疗的4例肾阳虚证患者者治疗前后的蛋白质组进行鉴定，获得了一批差异表达达蛋白[1]。蛋白质功能的实现不是孤立的，而是以蛋白白质之间的相互作用为基础。右归丸对肾阳虚证疗效的的发挥也是蛋白质在一定时空下相互作用的结果。因因此，必须在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行行研究，才能对右归丸疗效的综合性和复杂性有全面面和深入的认识。本研究采用生物信息学网络建模方方法，对前期实验数据进行挖掘，从蛋白质相互作用关关系角度探索右归丸治疗肾阳虚证的分子机制。

1　资料与方方法

1.1数据来来源

数据来来源于前期实验采用8通道iTRAQ蛋白质组学技术检检测得到的蛋白质组数据[1]，对其中标记实验中8个通通道均有定量信息的171个蛋白质作进一步数据分析。

1.2差异表表达蛋白质筛选

分别计计算各鉴定蛋白质在治疗前后表达量的平均值，采用用配对t检验比较治疗前后差异，P＜0.05认为该蛋白白质的表达差异有统计学意义。

1.3蛋白质质相互作用网络构建

采用STRING（http://string-db.oorg）数据库[2]构建差异蛋白质质相互作用网络。STRINGG是用于搜寻已知蛋蛋白质和预测蛋白质之间相互作用的系统，其采用的预预测方法有染色色体临近、基因融合、系统进化谱和基于于芯片数据的基基因共表达等，系统利用打分机制对这些些方法得出的结结果给予一定权重，最终给出综合得分。综综合得分越高高，则蛋白质间相互关系越紧密。采用A miGO（http:///amigo.geneontology.org/rte）[3]对网络中各蛋白质模块进进行Gene Ontology（GO）功能富集分析。

2　结果

2.1差异蛋白白质筛选结果果

与治疗前比较，有7个个蛋白质的表达在治疗后出现现明显差异（PP＜0.05），其其中4个蛋白表达上调、3个个蛋白表达下调，见表1。

2.2蛋白质相相互作用网络络

7个差异表表达蛋白质和和另外10个个预测蛋白质构成成了差异蛋白质相互作用网网络（见图11）。该网络包含177个节点（蛋蛋白质）、57条边（相互互作用关系），其中有22个边的的综合置信值（confidencce value）＞0.7。

2.3相互作用用蛋白质及其功能

将每个差异蛋白质及其预测蛋白质输入AmiGO数数据库，分别别从分子功能、细胞组分、生物学过程3个个方面对每个个差异蛋白质及其预测蛋白质作功能显著著性分析，以P≤0.001为标准，获得各差异蛋白质及及其预测蛋白质显著性GOO类别，见表2。

表1　肾阳虚证患患右归丸治疗前后后血清差异表达蛋白质

图1　肾阳虚虚证差异表达蛋白质相互作用网络

表2　与差异表达蛋白质发生相互作用的蛋白质及其功能富集（预测值＞0.7）

3　讨论

右归丸为治疗肾阳虚证的经典方剂，其临床疗效已被证实，但其疗效机制还仅得到部分阐释[4]。我们前期在右归丸治疗前后对照的4例肾阳虚证患者中成功鉴定出了236个血清蛋白，并对筛选的差异表达蛋白进行了初步的功能分析。然而，前期实验只是对单个差异蛋白质的功能进行了分析，而对蛋白质间的相互作用关系未作研究。在生物学过程中，蛋白质之间的相互作用是介导生物体整体变化的基础，其生物学意义显然远高于单个蛋白质的变化[5]。从蛋白质相互作用数据出发构建蛋白质相互作用网络，并从中预测出与功能密切相关的模块，已成为研究复杂科学的一种手段。为了进一步研究右归丸对肾阳虚证干预效应的网络化调节机制，本研究对前期实验数据作进一步的数据挖掘，重点分析差异蛋白质的功能网络关系。要获取蛋白质相互作用网络，需借助生物信息学网络建模方法。目前，可实现蛋白质相互作用网络的数据库有Osprey[6]、InterViewer[7]、Pajek[8]、STRING[2]等。STRING数据库是一个搜寻已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的系统。这种作用既包括蛋白质之间直接的物理的相互作用，也包括蛋白质之间间接的功能相关性，具有操作简单、可视化效果明显的特点。

借助STRING网络建模数据库，我们构建了7个差异表达蛋白相互作用网络。在该网络中，7个差异表达蛋白和10个预测蛋白质发生相互作用，共形成22对蛋白质相互作用关系，说明右归丸疗效相关蛋白质的作用并不是孤立的，而是相互联系，彼此作用，共同发挥特定生物学功能。每个差异表达蛋白质和其预测蛋白质功能相似，构成一个蛋白质相互作用功能模块，每个模块都主导着其相应的生物学过程，主要涉及补体激活、创伤愈合、体液水平调节、血液凝固等。其中C3、C5和CFH均为补体系统重要成分。C3是补体系统的中心成分，处在补体激活的3条途径枢纽位置，它既参与天然防御，同时还可触发适应性免疫调节[9]。C5也是补体系统的一种重要组分，其裂解成分C5a对免疫应答有明显增强作用，可诱导单核细胞分泌白细胞介素（IL）-l、IL-6、IL-8及肿瘤坏死因子[10]等细胞因子，促进抗原及同种异体抗原诱导的T细胞增殖及B细胞产生抗体等。本研究结果显示，肾阳虚证患者C3和C5经右归丸治疗后均出现差异表达，而且与蛋白质相互作用网络中多个蛋白发生相互作用，并参与了多个功能的执行，说明右归丸对肾阳虚证的调控作用是多层次的，这和中医理论强调的整体调节理念是一致的。本研究通过对网络中重点蛋白质节点的功能挖掘，得到了一些右归丸疗效相关的核心调控蛋白，如免疫调节功能相关的蛋白如C3、C5、CFH等，提示在右归丸治疗肾阳虚证的众多疗效机制中，补体系统成分可能为其促进免疫平衡的分子基础之一。

总之，本研究应用蛋白质组学技术筛选右归丸治疗肾阳虚证的差异表达蛋白，从蛋白质相互作用关系角度，构建差异蛋白质相互作用网络，并分析网络中蛋白模块的功能，从宏观角度分析右归丸对肾阳虚证的分子调控路径，为右归丸治疗肾阳虚证的临床疗效提供了依据。

参考文献：

[1] 谭从娥,黄祥云,郭小青.应用iTRAQ技术筛选右归丸对肾阳虚证干预效应的血清差异表达蛋白[J].时珍国医国药,2014,25(9)：2277-2279.

[2] SZKLARCZYK D, FRANCESCHINI A, WYDER S, et al. STRING v10：protein-protein interaction networks, integrated over the tree of life[J]. Nucleic Acids Res,2015,43(Database issue)：D447-D452.

[3] CARBON S, IRELAND A, MUNGALL C J, et al. AmiGO：online access to ontology and annotation data[J]. Bioinformatics,2009,25(2)：288-289.

[4] 李梢.中医证候生物分子网络标志的构想与研究[J].中医杂志,2009, 50(9)：773-776.

[5] 谭从娥,王米渠.右归丸对肾阳虚证患者干预效应的差异表达基因功能网络分析[J].中成药,2013,35(9)：1875-1878.

[6] BREITKREUTZ B J, STARK C, TYERS M. Osprey：a network visualization system[J]. Genome Biol,2003,4(3)：R22.

[7] JU B H, PARK B, PARK J H, et al. Visualization and analysis of protein interactions[J]. Bioinformatics,2003,19(2)：317-318.

[8] DE NOOY W, MRVAR A, BATAGELJ V. Exploratory social network analysis with Pajek[M]. New York：Cambridge University Press, 2005：1-10.

[9] 昝琦,刘欣,逄越,等.补体C3结构与功能研究进展[J].中国免疫学杂志,2014,30(4)：549-553.

[10] GUO R F, WARD P A. Role of C5a in inflammatory responses[J]. Annual Review of Immunology,2005,23：821-852.

（修回日期：2015-05-27；编辑：陈静）

Analysis of Therapeutical Mechanism of Yougui Pills for Kidney-yang Deficiency SyndromeBased on Protein-protein Interaction Network

TAN Cong-e, HUANG Xiang-yun (Shaanxi University of TCM, Xianyang 712046, China)

Abstract:Objective To develop a protein-protein interaction network related to therapeutic effects of Yougui Pills on kidney-yang deficiency syndrome; To explore the therapeutical mechanism of Yougui Pills for treating kidney-yang deficiency syndrome. Methods The proteome data obtained from previous experiments were applied again to do further data mining: first, differentially expressed serum proteins between kidney-yang deficiency patients in pre-treatment and post-treatment of Yougui Pills were screened; second, a protein-protein interaction network of differentially expressed proteins with STRING database was constructed. The key proteins in the network were positioned and their functions were enriched in gene ontology (GO) terms with AmiGO database. Results Seven serum proteins were found expressed differentially. These differentially expressed proteins were interacted with 10 predicted proteins. The constructed protein-protein interaction network consisted of 17 nodes (proteins) and 57 edges (interactions). 22 edges reached high confidence of 0.7. The key network proteins of C3, C5 and CFH were important components of complement system, and their main functions were both involved in immune regulation. Conclusion Yougui Pills can regulate kidney-yang deficiency in many ways, including complement activation, wound healing, regulation of body fluid levels, etc. In these actions, the regulation on complement system may be one of the important mechanisms of Yougui Pills on kidney-yang deficiency syndrome.

Key words:kidney-yang deficiency; Yougui Pills; protein-protein interaction network

收稿日期：（2015-04-20）

基金项目：国家自然科学基金（81072731、81473559）；陕西省教育厅自然科学专项（2013JK0821）

中图分类号：R228；R2-05

文献标识码：A

文章编号：1005-5304(2016)02-0030-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.009