蔓越橘植物性化学物质与亚铁离子螯合作用对细菌生长的影响

严 帆，方平平，靳卫亚

(安徽师范大学花津校区，安徽芜湖 241000)



蔓越橘植物性化学物质与亚铁离子螯合作用对细菌生长的影响

严 帆，方平平，靳卫亚

(安徽师范大学花津校区，安徽芜湖 241000)

摘要[目的]探讨蔓越橘汁中植物性化学物质与生长环境中亚铁离子的螯合作用是否为蔓越橘汁抑菌的主要因素。[方法]采用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌为对象，乙二胺四乙酸(EDTA)为参照物，利用平板涂布方法研究蔓越橘植物性化学物质与亚铁离子螯合作用对细菌生长的影响。[结果]随着亚铁离子溶液浓度的提高，蔓越橘汁固相萃取物组金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长曲线相对低于EDTA组，甚至出现过量亚铁离子抑制细菌生长的现象。[结论]蔓越橘汁的抑菌原理主要来源于植物性多酚物质对细菌的作用，而非间接的与亚铁离子螯合作用。

关键词蔓越橘；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；EDTA

Effects of Sequestration of Cranberry Phytochemicals and Iron Ion on the Growth of Bacteria

YAN Fan, FANG Ping-ping, JIN Wei-ya( Huajin Campus of Anhui Normal University, Wuhu, Anhui 241000)

Abstract[Objective] To determine whether sequestration of cranberry phytochemicals and iron ion was the main factor affecting the bacteriostasis of cranberry juice. [Method] With Gram-positive bacteriaStaphylococcusaureusand Gram-negative bacteriaEscherichiacolias the research materials and EDTA as reference substance, effects of sequestration of cranberry phytochemicals and iron ion on bacteria growth were researched by spread-plate method. [Result] With the increase of iron ion concentration, the growth speeds ofS.aureusandE.coliin solid phase extraction (SPE) of cranberry juice was lower than those in EDTA group; excessive iron ion even inhibited the growth of bacteria. [Conclusion] The main bacteriostasis mechanism of cranberry juice is the effects of plant polyphenols on bacteria, but not the sequestration with iron ion.

Key wordsCranberry;S.aureus;E.coli; EDTA

蔓越橘(Vacciniummacrocarpon)为杜鹃花科越橘属常绿灌木，主要生长在北半球暖温带且土质为酸性泥炭土的山丘或平原中[1]。蔓越橘的营养成分种类多、含量高，并且果实中含有多种生物活性成分，具有多种保健功能。蔓越橘在保护视力、控制尿路感染、预防血栓和动脉硬化、维持正常血压等方面具有较好效果[2]。关于蔓越橘能够有效抑制细菌生长的研究常有报道[3-6]，但关于其抑菌机理的研究鲜有报道。为此，笔者以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌为研究对象，探究了蔓越橘植物性化学物质与亚铁离子螯合作用对细菌生长的影响，以期为蔓越橘汁的抑菌机理研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。 蔓越橘汁(Ocean Spray，美国)于2014年3月通过邮寄方式从澳大利亚墨尔本当地超市购买。革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)纯菌种(ATCC 25923)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)纯菌种(ATCC 25922)均取自安徽师范大学生命科学学院菌种保藏实验室。

1.1.2主要试剂。营养肉汤(NB)、贝尔德帕克琼脂(BPA)和胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)等均购自浙江杭州天和微生物试剂有限公司；C18固相萃取(SPE)柱购自爱尔兰Waters公司。

1.1.3主要仪器。XFS-280A手提式压力蒸汽灭菌锅由浙江新丰医疗器械有限公司生产； SF-CJ-2B超净工作台由上海三发科学仪器有限公司生产； LHP-250恒温培养箱由上海三发科学仪器有限公司生产；RE型旋转蒸发仪由上海亚荣生化仪器厂生产。

1.2方法

1.2.1蔓越橘汁的浓缩。量取50.0 mL甲醇和100.0 mL蒸馏水润洗SPE柱，过滤300.0 mL蔓越橘汁。过滤时，蔓越橘汁有机物质和糖分与酚类物质分离，酚类物质回收在100.0 mL甲醇溶液中，形成酚类物质甲醇洗脱液。酚类物质甲醇洗脱液用旋转蒸发仪在55 ℃下蒸发至回收装置中至不再有甲醇滴下为止，在室温下用100.0 mL灭菌水溶解残留物，得到总酚含量3倍浓缩的样液。该样液用10%氢氧化钠溶液调节pH至中性，采用0.2 μm一次性针头滤器膜过滤，4 ℃储存备用。

1.2.2线性关系的考察。称取(0.110±0.001) g没食子酸(GA，相对分子质量188.14)，于100.0 mL容量瓶中溶解并定容，摇匀。用移液管分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL没食子酸标准储备溶液于100.0 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，浓度分别为10、20、30、40、50、60 μg/mL。用移液管分别移取没食子酸工作液、水及测试液各1.0 mL于刻度试管中，在每个试管中分别加入5.0 mL福林酚试剂，摇匀。反应5 min后，加入4.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，加水定容，摇匀。置于25 ℃恒温水浴锅中60 min，显色后于765 nm波长下测定吸光度，绘制浓度与吸光度的标准曲线。

1.2.3培养基的配制。称取NB干粉22.000 g，加入蒸馏水1 000.0 mL溶解，分装8.0 mL NB溶液至透明试剂小瓶中，121 ℃高压灭菌30 min，常温冷却后，4 ℃储存备用。称取BPA干粉58.000 g，加热搅拌溶解于1 000.0 mL 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至50 ℃左右，于培养基中加入常温解冻的卵黄亚碲酸钾增菌剂50.0 mL 摇匀后倾入无菌平皿。使用前在冰箱贮存不超过48 h。称取TSA干粉40.000 g，加热搅拌溶解于1 000.0 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，常温冷却后，4 ℃储存备用。称取氯化钠9.000 g溶于1 000.0 mL蒸馏水中，分装9.0 mL 生理盐水溶液至透明试剂小瓶中，121 ℃高压灭菌30 min，常温冷却后，4 ℃储存备用。

1.2.4细菌活化。分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌放入灭菌后的NB小瓶中，摇匀，37 ℃恒温培养24 h。对活化后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行梯度稀释，计算原菌液浓度，再配制浓度为6 log cfu/mL的菌悬液备用。

1.2.5对照试验。根据表1设置不同的对照试验，包括：蔓越橘汁SPE和不同浓度的亚铁离子(Fe2+)溶液对金黄色葡萄球菌生长的影响；蔓越橘汁SPE和不同浓度的亚铁离子溶液对大肠杆菌生长的影响；EDTA和不同浓度的亚铁离子溶液对金黄色葡萄球菌生长的影响；EDTA和不同浓度的亚铁离子溶液对大肠杆菌生长的影响。每组分别在0、3.5、7、24 h进行细菌平板涂布试验，37 ℃恒温培养24~48 h。每个梯度做3个平行试验。结果均以log cfu/mL为单位基数表示。

表1　蔓越橘汁与亚铁离子浓度对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长影响的试验设计

注：*10 μL在10 mL的体系中只占1/1 000，对体积的影响可忽略不计。

Note：* 10 μL was only 1/1 000 of the 10 mL system，the impacts of which could be neglected.

1.2.6数据处理。结果计为平均值±标准偏差。运用SPSS16.0软件对数据进行方差分析(ANOVA)，计算LSD，分析样品间差异显著性。

2结果与分析

图1　没食子酸标准曲线Fig.1　Standard curve of garlic acid

2.1蔓越橘汁植物性总多酚含量测定结果经过SPE柱洗脱后，蔓越橘汁中糖、VC等极性分子被移除，经氢氧化钠调节至pH中性后，蔓越橘汁SPE主要成分为植物性多酚。由图1可知，没食子酸浓度为1~6 μg/mL时，与吸光度成良好的线性关系，线性回归方程为：y=0.167 7x+0.125 5，相关系数R2=0.999 4。采用福林酚法测得浓缩3倍后的蔓越橘汁SPE植物多酚含量为(967±1)μg GAE/mL，原蔓越橘汁植物总多酚含量为(293±1)μg GAE/mL，植物性总多酚回收率高达91%，测量结果与前人研究[7]相符合。

2.2蔓越橘汁SPE抑制细菌生长测定结果由图2可知，与相应对照组对比，蔓越橘SPE抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长分别达0.847和1.087 log cfu/mL(P<0.05)。随着亚铁离子溶液浓度的增加，金黄色葡萄球菌的生长所有增加，但无显著差异。CE2、CE3和CE4组中大肠杆菌生长曲线与金黄色葡萄球菌走势趋同(P> 0.05)，但CE5并未达到预期增加大肠杆菌增长的效果，培养24 h后反而比CE4降低了0.430 log cfu/mL。

2.3EDTA抑制细菌生长测定结果与相应对照组对比，10 mmol/L EDTA 溶液抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长分别达1.403和1.229 log cfu/mL(P<0.05)。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活菌数随着亚铁离子溶液浓度的增加而显著增加，1 mmol/L 亚铁离子处理组与对照组菌落数接近(P>0.05)，2 mmol/L 亚铁离子处理组比对照组分别增加了0.211和0.169 log cfu/mL(图3)。

注：A.金黄色葡萄球菌；B.大肠杆菌。Note：A.S.aureus; B.E.coli.图2　蔓越橘SPE和不同浓度亚铁离子溶液对细菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的影响Fig.2　Effects of cranberry SPE and Fe2+ concentration on the growth of S.aureus and E.coli

注：A.金黄色葡萄球菌；B.大肠杆菌。Note：A.S.aureus; B.E.coli.图3　EDTA和不同浓度亚铁离子溶液对细菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的影响Fig.3　Effects of EDTA and Fe2+ concentration on the growth of S.aureus and E.coli

3结论与讨论

3.1结论蔓越橘汁的抑菌原理主要来源于植物性多酚物质对细菌的作用，而非间接的与亚铁离子螯合作用。

3.2讨论在有氧生长条件下，铁离子在多数细菌生长过程中起重要作用[8]，也是灭菌过程中的一种重要限制营养素[9]。蔓越橘汁中植物性总多酚物质包含黄酮类、原花青素和花青素，它们都含有1个或多个能够和亚铁离子发生强烈螯合作用的邻位双羟基多酚氢氧化基团[8，10]。因此，多酚物质与亚铁离子的螯合作用可能是抑制细菌生长的原理被假设[10-12]。蔓越橘汁中有的多酚物质含有不止1个可以与铁离子发生螯合作用的基团，这些基团可能与铁离子发生螯合作用从而导致细菌生长过程中铁离子不足，发生抑制细菌生长的现象。该研究表明，蔓越橘汁植物性多酚物质可有效抑制革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌，与其他文献数据类似[3，7-8]。

铁离子缺乏情况下，细菌可产生4种在周围环境中寻找铁离子的铁载体。然而，强效的铁离子螯合剂EDTA加入细菌的生长环境中，迅速吸收亚铁离子，从而导致细菌生长环境铁离子缺乏产生抑菌现象[7]。该研究表明，加入过量亚铁离子后，细菌菌落数有回升迹象，表明EDTA与亚铁离子螯合作用是抑制细菌生长的主要机理。

该研究还发现，随着亚铁离子溶液浓度的提高，加入蔓越橘汁SPE组的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长曲线并不如EDTA组中生长迅速，甚至出现过量亚铁离子抑制细菌生长的现象。已有文献证明，多酚物质可以引起革兰氏阴性细菌外细胞膜局部瓦解，导致细胞质外渗死亡[9，13]；多酚物质进入细菌菌体内，与DNA物质相互作用导致细菌死亡等[14]。因此，蔓越橘汁的抑菌原理主要来源于植物性多酚物质对细菌的作用，而非间接的与亚铁离子螯合作用。

参考文献

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收稿日期2015-12-24

作者简介严帆(1988- )，女，安徽芜湖人，讲师，硕士，从事食品微生物、食品化学研究。

基金项目安徽师范大学青年教师科研专项(721355)。

中图分类号S 666.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-019-03