结核分枝杆菌基因分型技术研究进展

张　志，罗保斌，刘东艳，董明纲

(1.河北医科大学附属石家庄市第五医院检验科，河北 石家庄 050021；2.北京中医药大学东直门医院检验科，北京 100700；3.河北北方学院学报编辑部，河北 张家口 075000)



结核分枝杆菌基因分型技术研究进展

张志1，罗保斌2，刘东艳2，董明纲3

(1.河北医科大学附属石家庄市第五医院检验科，河北 石家庄 050021；2.北京中医药大学东直门医院检验科，北京 100700；3.河北北方学院学报编辑部，河北 张家口 075000)

结核分枝杆菌；基因分型；插入序列6110限制性片段长度多态性分析技术；数目可变串联重复序列技术；间隔区寡核苷酸分型技术；单核苷酸多态性分析技术；长片段多态性分析技术

结核分枝杆菌(Mycobacterialtuberculosis,MTB)是结核病的病原体，可累及全身多种组织器官，以肺组织受累最常见。近几年由于流动人口的增加和HIV病毒感染的流行，结核病再次成为严重危害世界公共卫生的传染病之一。结核病再度肆虐,其主要原因之一就是结核分支杆菌的变异。因此从分子水平研究结核分枝杆菌的基因特征并进行分型鉴定,明确主要流行菌型，以更准确地预测和判断结核病的暴发流行及传播方式，对有效防治结核病具有重大意义。现就常用的MTB基因分型技术作一综述。

随着分子生物学技术的进步，结核分枝杆菌的基因分型技术发展迅速，目前常用的技术包括插入序列6110限制性片段长度多态性分析技术(IS6110-RFLP)、数目可变串联重复序列技术(variable number tandem repeats，VNTR)、间隔区寡核苷酸分型技术(spoligotyping)、单核苷酸多态性分析技术(single nucleotide polymorphism,SNP)和长片段多态性分析技术(large sequence polymorphism,LSP)等。

1　插入序列6110限制性片段长度多态性分析技术(IS6110-RFLP)

IS6110是结核分枝杆菌特有的、随机插入染色体内的重复序列。IS6110-RFLP是用IS6110作为探针进行限制性片段长度多态性分析的一种DNA指纹图谱技术，是第一个广泛应用的MTB基因分型技术。该技术是从结核分枝杆菌培养基中刮取菌株，提取纯化DNA，用限制性内切酶在特定位点切割DNA获得不同长度的DNA片段，将其在琼脂糖凝胶上电泳分离，Southern免疫转印，用标记的DNA IS6110序列中的某片段作为探针，进行杂交，经放射自显影，即获得限制性片段长度多态性图谱[1]。无流行病学联系的患者体内分离的MTB菌株呈现出不同的RFLP图谱，而近期传播的患者体内分离的MTB菌株呈现出相同的指纹图谱，因此可追踪MTB在人群中的传播情况。该技术对IS6110拷贝数大于6的菌株分辨率较高，对IS6110拷贝数少或无IS6110的菌株难以进行分型鉴定，需要辅以其他分型方法。IS6110-RFLP分型技术需要培养3～6周才能获得足够的DNA量，操作繁琐、费时，同时图谱识读需要软件支持，在一般实验室难以推广，因此目前该技术一般作为补充和参考标准使用[2]。

2　数目可变串联重复序列(VNTR)分型技术

MTB染色体中存在很多结核分枝杆菌散在重复单位(MIRU)，每一位点包括多个首尾相连的完全相同或有轻微差异的重复序列，即数目可变串联重复序列(VNTR)。VNTR分型法是以聚合酶链反应(PCR)为基础，建立在数目可变串联重复序列上的基因分型技术，也称MIRU-VNTR技术[3]。以VNTR位点序列设计引物，进行PCR扩增，扩增产物与标准DNA ladder同时进行电泳分离，根据电泳图谱判读每一位点的拷贝数，从而为每一菌株建立数字化的数据库。目前，实验室常用的有15位点和24位点两种分型法，其中15位点可用于分子流行病学研究，24位点可用于系统发育学(菌株遗传结构)研究[4-5]。VNTR分型技术的分辨率接近IS6110-RFLP，对IS6110拷贝数少的菌株也有很好的分型能力[6]。该技术操作简单、成本低廉、重复性好、数字化的结果很容易在计算机数据库内分类，便于不同实验室结果比较，可用于结核病流行病学研究，监测耐药MTB菌株传播情况。然而，在中国结核病流行广泛，传播力较强，北京型菌株高发，所获得的MTB菌株数量大，基因同质化比率高，采用15位点VNTR分型法不能完全区分菌株，虽然24位点VNTR分型法的分辨率可以接受，但不利于推广，因此VNTR基因分型技术的位点选择具有很强的地域性[7]，需要不断完善，寻找适合本国家、本地区的多态性位点，或与其他分型技术相结合，提高分辨率。

3　间隔区寡核苷酸分型技术(spolig-otyping)

在MTB染色体中，有一个直接重复(direct repeat,DR)区，包含10～50个拷贝的由36个碱基(base pair,bp)组成的直接重复序列和35～41bp的非重复间隔序列。不同菌株之间的间隔区序列具有保守性。Spoligotyping分型法是利用43个特定间隔区的缺失或存在进行多态性分析的分型技术。北京型菌株具有相同的特征性间隔序列，表现为仅与35～43之间的9个间隔区杂交呈现阳性反应，因而该技术被公认为北京家族菌株鉴定的金标准[8]。该技术只需少量DNA，操作简便、重复性好，实验结果数字化，易于实验室间结果比较，能对IS6110低拷贝菌株进行分型，但分辨率不及IS6110-RFLP分型法，不能识别复合感染，故仅适用于MTB初筛或基因群的分型[9]。目前常将spoligotying与VNTR相结合，用于MTB基因分型[10-11]。

4　单核苷酸多态性分析技术(SNP)和长片段多态性分析技术(LSP)

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。长片段多态性(LSP)的产生可能是由于基因组大片段的基因缺失或重排导致的[12]。随着全基因组测序分析的快速发展，各种有代表性的结核菌株测序完成，MTB基因组间比对成为可能。研究发现菌株的LSP和SNP具有较高的遗传稳定性，SNP能够鉴定出全球流行的MTB六大谱系，并能够通过SNP研究菌株的微进化来判断局部地区菌株群体结构，适用于系统发育学研究[13]。长片段多态性分析(LSP)和基于核转录因子(nuclear transcription factors,NTF)基因分型法，可将北京家族菌株分为不同的亚型[14-15]。在NTF区域有1～2个IS6110插入时，为典型的“现代型”；若NTF区域完整，无IS6110插入序列，则为“古典型”。LSP中的长片段RD105存在于所有的北京型菌株，故可作为北京家族菌株的鉴别方法。其他LSP，如RD181、RD142、RD150，能够将北京家族菌株细分为不同的亚型，从而更加全面分析地北京型菌株的相关特征[14-16]。但是，SNP需要测序，价格昂贵，无法在实验室间推广，SNP和LSP对菌株的分辨率不高，在追踪传染源、查找传播途径方面难以替代传统的基因分型技术。

基因分型技术是结核病分子流行病学研究中的重要内容，在结核病近期传播追踪、暴发流行调查、实验室污染鉴定、内源性复染和外源性再感染的区分等方面具有重大意义。目前IS6110-RFLP、MIRU-VNTR和spoligotyping是国内外流行病学研究工作中最常用的三种方法，已有相应的标准操作流程。MIRU-VNTR和spoligotyping已有相应的国际数据库网站，便于各国研究者发布或比对数据。每个分型技术都有各自的优缺点，在实际工作中需要多种方法联合应用能够提高分辨率，达到理想的分型效果。

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[责任编辑：李蓟龙]

张志(1980-)，男，石家庄市人，硕士研究生，主管检验师。

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10.3969/j.issn.1673-1492.2016.06.030

来稿日期：2016-02-27