Wnt信号通路在骨细胞生物学及骨疾病中作用的研究进展

张晓清， 岳 丹,2， 贾 楠， 由 涌， 王 笑， 孙 逊*

(1．中国医科大学基础医学院 免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学附属盛京医院 检验科，辽宁 沈阳 110004)

Wnt信号通路在骨细胞生物学及骨疾病中作用的研究进展

张晓清1， 岳 丹1,2， 贾 楠1， 由 涌1， 王 笑1， 孙 逊1*

(1．中国医科大学基础医学院 免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学附属盛京医院 检验科，辽宁 沈阳 110004)

Wnt信号通路参与细胞增殖、胚胎发育、组织再生和干细胞维持等多种生物学过程。近年来，Wnt信号通路在骨骼系统发育及代谢过程中的作用引起广泛关注。探讨Wnt信号通路调节成骨细胞分化、增殖以及维持整个骨骼系统平衡的分子机制，对于临床治疗各种骨疾病(如骨质疏松)具有重要意义。

Wnt信号通路；骨代谢；骨疾病

Wnt信号通路是机体进化过程中高度保守的信号通路,其在胚胎发育，组织分化和肿瘤发生中发挥重要作用。同时，Wnt信号通路在骨骼系统发育及代谢过程中也起到重要作用。目前，按激活β-catenin的能力将Wnt信号通路分为经典信号通路和非经典信号通路，其中以经典Wnt信号通路在骨细胞生物学中的作用研究较为广泛。经典Wnt信号通路,又称“Wnt/β-catenin信号通路”，主要通过富集细胞内的β-catenin，促进β-catenin进入细胞核，进而调控下游成骨细胞靶基因的表达，促进成骨细胞分泌I型胶原而加速骨组织矿化，促进间充质前体细胞和骨-软骨细胞前体细胞增殖分化为成骨细胞和软骨细胞，延长成骨细胞的存活时间[1]；并且抑制成骨细胞和破骨细胞的偶联，调节骨保护素(Osteoprotegerin, OPG)和核因子-κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)的表达，影响骨吸收；使包埋在骨基质中的骨细胞最终分化为成骨细胞，并改变OB/OC的胞外基质以及在骨表面的定位，刺激骨折修复和影响骨重塑[2]。非经典Wnt信号通路，包括Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/PCP(Planar Cell Polarity)信号通路。Wnt/Ca2+信号通路主要通过调节G蛋白激活胞质中多种对Ca2+敏感的酶，包括磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)、蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)和钙离子-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calcium-calmodulin dependent kinase Ⅱ，CamKⅡ)等，进而调节细胞内Ca2+的释放[3]；Wnt/PCP(Planar Cell Polarity)信号通路，主要通过小G蛋白RhoA和Cdc42等激活Jun N端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK), 促进软骨细胞的去分化[4]。

1 Wnt蛋白家族

Wnt蛋白家族由19个分泌型糖蛋白组成，相对分子质量为39～46 kD，富含半胱氨酸，通过自分泌或旁分泌方式与细胞膜受体结合，参与调控细胞增殖、分化和凋亡等，对胚胎的发育和组织的再生起到重要作用[5]。现已发现Wnt蛋白家族的19个成员中Wnt3a、Wnt5a和Wnt10b具有调节成骨细胞的功能，而Wnt14能够促进软骨内骨形成[6]。

2 Wnt信号通路相关蛋白

2.1 细胞膜受体

2.1.1 低密度脂蛋白受体相关蛋白(Low-density lipoprotein receptor-related protein, LRP) LRP是进化保守的细胞膜受体，有多种功能包括脂代谢、物质运输和细胞信号转导[7]。LRP5/LRP6是Wnt蛋白的共受体，均为单跨膜蛋白，两者具有高度的同源性，胞外部分和胞内部分的同源性分别为73%和64%。这类单跨膜蛋白的胞外部分含有4～6个β-螺旋结构，每个β-螺旋结构后面都有一个表皮生长因子样结构域，可以与Wnt蛋白结合，激活Wnt信号[8]。研究发现LRP5的变化对骨细胞的分化和功能影响较大，LRP5 功能缺失性突变将导致小鼠成年时表现为由骨形成减少造成的骨量下降，在人类表现为一种常染色体隐性疾病-骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-pesudoglioma syndrome，OPPG)[9]；而功能获得性突变LRP5将导致高骨量(High bone mass，HBM)的表型[10]。

2.1.2 卷曲蛋白(Frizzleds，Fzd) Fzd是Wnt的细胞膜表面受体，至今已发现人类有10种Fzd分子，小鼠有9种。Fzd为7次跨膜蛋白，其N端含有一段半胱氨酸富集结构域(Cysteine-rich domain，CRD)的胞外区，并通过该区域与Wnt蛋白结合[11]。Fzd可以活化经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路，但是与Wnt蛋白结合后，Fzd向细胞内传递信号的分子机制目前尚不清楚[12]。

2.2 细胞浆内的信号转导部分

2.2.1 β-catenin β-catenin是由Ctnnb1基因编码的相对分子质量为88 kD的蛋白质，其N 端富含丝氨酸和苏氨酸残基区能结合APC、Axin和自身的区段[13]。β-catenin参与许多信号通路，包括Wnt信号通路，是Wnt信号通路中最重要的分子。当Wnt信号通路未被激活时，β-catenin被磷酸化而启动泛素系统，经蛋白酶体途径降解。当Wnt信号通路被激活时，β-catenin与核内转录因子(TCF/LEF)结合启动靶基因的转录[14]，促进成骨细胞分化增殖。间充质前体细胞中β-catenin缺失影响骨骼代谢过程，主要表现在骨矿化作用减少、成骨细胞生成减少[15]；Ctnnb1缺失的成骨细胞与骨细胞分泌OPG的能力下降，从而促进破骨细胞的分化增殖，继而导致骨吸收增加。

2.2.2 腺瘤性结肠息肉病(Adenomatous polyposis coli，Apc)蛋白 Apc是一种抑癌基因，最初是在结肠腺瘤样息肉病人中发现的，并以此命名。Apc缺陷可导致家族性腺瘤息肉病，为一种常染色体显性遗传的癌前病变，通常可发展为结肠癌。Apc属于Wnt信号通路的负调控因子，其主要功能是调节细胞内β-catenin的水平。Apc可与Axin、GSK3β等构成一个降解复合物，当无Wnt信号传入时，该复合物可与β-catenin特定位点结合，使游离的β-catenin降解；当有Wnt信号传入时，该复合物的降解功能受抑制，β-catenin在细胞内蓄积并进入细胞核，与核内转录因子(TCF/LEF)结合，启动下游靶基因的表达[16]。

2.2.3 骨架蛋白Axin Axin作为一个骨架蛋白，可以与GSK3β、APC、β-catenin及其他许多蛋白相结合，所形成的降解复合体可以导致β-catenin磷酸化和降解[17]。研究表明，Wnt信号可以引发GSK3β对LRP6的胞质端进行磷酸化，进而促使胞质中的Axin和其他降解复合物被招募到胞膜上与LRP6结合，激活下游β-catenin信号通路[18]。

2.2.4 糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β) GSK3β是一种蛋白激酶，广泛参与多种信号通路，包括经典和非经典Wnt信号通路。目前研究证明，GSK3β可以磷酸化Wnt通路中的多个分子，包括β-catenin、Axin和Apc。β-catenin N-末端被GSK3β磷酸化后促进其通过26S蛋白酶体降解。GSK3β对Wnt信号也有积极的作用。GSK3β和Axin向胞膜移动并与配体结合，使 Wnt受体LRP5/6发生磷酸化[19]。LRP5/6磷酸化形成了大量蛋白质信号小体，从而隔绝GSK3β，促进β-catenin积累和基因转录[20]。很多研究表明抑制GSK3β可促进骨形成。通过基因敲除或药物抑制GSK3β可增加骨密度。GSK3β基因敲除小鼠胚胎不能存活，但GSK3β+/-小鼠骨小梁密度增高，单位面积成骨细胞数量增多，骨形成率增加。

3 核内的转录调控部分

T细胞因子(T cell factor，TCF)和淋巴增强因子(Lymphoid enhancer binding factor，LEF)是将Wnt信号和β-catenin连接到基因组的核内蛋白[21]。LEF/TCF 通过C-末端DNA结合域与DNA序列-YCTTTGWW-相结合，并通过N-末端序列与核内β-catenin结合形成异二聚体，进一步结合DNA激活靶基因的转录,促进成骨细胞的分化增殖[22]；而LEF/TCF缺失则表现为成骨细胞数量减少、活性降低[23]。

4 Wnt信号通路的拮抗剂

Wnt信号通路还受许多不同拮抗分子的抑制性调节。到目前为止共发现两类Wnt信号通路的胞外拮抗分子。第一类主要是sFRP、Cerberus和WIF1，它们直接与Wnt蛋白结合, 从而拮抗Wnt信号。第二类是DKK(Dickkopf)家族蛋白，可竞争性地与Wnt蛋白受体 LRP5/6结合，从而干扰LRP5/6与Wnt-Frizzled复合物的结合，抑制经典Wnt信号通路的活性。

4.1 Dickkopfs(DKK)

DKK家族包括4个成员，均为分泌型糖蛋白，其中DKK1、DKK2、DKK4可以参与调控Wnt信号通路[24]，尤其以DKK1抑制Wnt通路而介导骨破坏的途径及其拮抗剂的研究最为广泛。DKK1与Wnt蛋白竞争性结合膜受体LRP5/6，并与膜受体Kremen结合，形成DKK1-LRP-Kremen复合体，经由吞饮作用进入胞浆并被溶酶体分解，从而减少了Wnt膜表面受体的数量，抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，下调胞浆β-catenin水平，抑制成骨细胞生长和分化的转录因子表达，使成骨细胞数量减少、活性降低、寿命缩短[25]。同时，成骨细胞Wnt/β-catenin通路被阻断后，下调骨保护素的表达水平，从而促进破骨细胞的分化[26]。大量研究表明，DKK1是体内骨代谢的负调节因子。在多发性骨髓瘤的患者中，恶性浆细胞产生大量DKK1，导致溶骨性病变。DKK1+/-小鼠由于严重的发育异常，出生后不久即死亡，但DKK1+/-小鼠骨形成和骨质量增加而没有代偿性骨吸收的改变[27]。转基因过表达DKK1能够显著降低成骨细胞的数量、骨形成率以及血清骨钙素水平。

近年来，大量研究集中于通过抑制DKK1来治疗各种骨损伤性疾病。在小鼠多发性骨髓瘤模型以及去卵巢引起的骨质疏松模型中，应用DKK1抗体可显著增加成骨细胞数量和血清骨钙素水平[28]；在TNF转基因小鼠模型中，应用DKK1抗体可对抗由TNF介导的炎症性骨丢失[29]。目前应用DKK1抗体治疗骨髓瘤也已经进入临床前期试验[30]。

4.2 分泌型卷曲蛋白相关蛋白(Sfrps)

Sfrps为分泌型的富含半胱氨酸的糖蛋白，是与Fzds受体高度同源性的Wnt天然拮抗剂。Sfrps直接与Wnt蛋白结合，阻止Wnt与细胞表面Fzd结合而抑制Wnt信号通路。Sfrps家族包含5个成员，其中Sfrp1～4表达于骨骼组织和成骨细胞,影响骨骼系统的发育和成骨细胞的功能。与野生型小鼠相比，Sfrp1基因敲除小鼠表现为成骨细胞和骨细胞分化、增殖增多，凋亡减少，进而导致骨量增多。相反，Sfrp1基因过表达小鼠则由于骨形成减少而导致骨量降低[31]。

5 小 结

在正常生理条件下，骨骼系统处于不断重建的过程中。成骨细胞介导骨形成，破骨细胞介导骨吸收，二者都是骨重建的重要细胞。Wnt信号通路不仅可以促进成骨细胞的分化增殖，同时还可以抑制破骨细胞的发育成熟，在骨骼系统的代谢过程中发挥重要作用。目前对经典Wnt通路的研究已经深入到基因水平，Wnt信号通路中的分子是如何调控整个信号通路，进而调控骨的发育、重塑和修复的过程也有了深入的研究。这些研究是理解罕见骨骼疾病、开发骨损伤性疾病药物治疗的分子基础，为治疗骨损伤性疾病指明新的方向。

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Advances in the Role of Wnt Signaling Pathway in Bone Cell Biology and Bone Diseases

ZHANG Xiao-qing1, YUE Dan1, 2, JIA Nan1, YOU Yong1, WANG Xiao1, SUN Xun1

(1.Teach. &Res.Div.ofImmunol.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122;2.Dept.ofLab.Med.,ShengjingHosp.,Schl.ofMed.,ChinaUni.,Shenyang110004)

The Wnt signaling pathway participates in cell proliferation, embryo development and tissue regeneration, and the maintenance of stem cells and many other biological processes. Recently, the role of the Wnt signaling pathway in the development of skeletal system and metabolism process has caused more and more attention. Research on Wnt signaling pathway to regulate the differentiation, proliferation of osteogenetic cells, and the molecular mechanism of the balance maintenance of the whole bone system have important significance on clinical therapy in various bone diseases such as osteoporosis.

Wnt signaling pathway; bone metabolism; bone diseases

国家自然科学基金项目(31370921)

张晓清 女，助理实验师，硕士。研究方向为黏膜免疫与感染免疫。E-mail：zhangxiaoqing2014@126.com

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。研究方向为黏膜免疫与感染免疫。E-mail：wsunxun1220@hotmail.com

2016-01-11；

2016-03-18

Q939.93;R378.99+4

A

1005-7021(2016)03-0096-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.018