大肠脱落细胞及其标记物筛查大肠癌的研究现状

李 阳，余小舫

暨南大学第二临床医学院,深圳市人民医院肝胆胰外科，广东 深圳 518020

大肠脱落细胞及其标记物筛查大肠癌的研究现状

李 阳，余小舫

暨南大学第二临床医学院,深圳市人民医院肝胆胰外科，广东 深圳 518020

大肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，目前手术仍是最有效的治疗手段，早期诊断和筛查可提高其手术切除率，目前的筛查手段主要有粪便隐血试验(fecal occult blood test，FOBT)、结肠镜、钡灌肠、CT等，然而这些筛查手段都存在一定的不足。近年来随着对结直肠息肉和腺瘤癌变过程中基因和表观遗传学改变认识的加深，人们开始对大肠脱落细胞及其成分进行检测，寻找便宜、安全、低格低廉、准确和依从性高的筛查方法。本文就大肠脱落细胞提取方法、脱落细胞及其成分检测的研究进展作一详细概述。

大肠癌；脱落细胞；标志物；筛查方法

全球范围内，大肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居恶性肿瘤第3位[1],每年有超过600 000人死于结直肠癌[2]。在中国，相关资料[3]估计2015年结直肠癌新增病例约37.63万，其相关死亡病例约19.10万，且随着人口的增加、人口老龄化、环境污染加重及高热量、高蛋白、低纤维饮食等逐渐西化的饮食习惯，其发病人数呈现逐年上升趋势。肿瘤的防止提倡“早发现、早诊断、早治疗”的三早原则，结直肠癌Ⅰ期和Ⅱ期的手术治愈率分别在90%和75%左右[4]，但大多数患者就诊时已属中晚期，丧失了手术切除的最佳时机且预后较差[5]。目前CRC的筛查方法主要有粪便隐血试验(fecal occult blood test，FOBT)、钡灌肠、乙状结肠镜、纤维结肠镜检查等。虽然这些筛查明显降低了结直肠相关的死亡率[6]，但仍存在一定的缺陷。FOBT由于无创、便宜、简单的特点被广泛运用到结直肠癌的筛查中，但存在敏感性低、假阳性和假阴性高的不足[7]。目前结肠镜被认为是结直肠癌诊断的“金标准”，但其不适感、有创、花费高、穿孔风险、对设备和内镜医师技术要求高等特点限制其广泛应用[8]。近年来随着对结直肠息肉和腺瘤癌变过程中基因和表观遗传学改变认识的逐步加深，人们尝试利用大肠脱落细胞及癌变过程中改变的基因和表观遗传学分子作为生物标记物对结直肠癌及其癌前病变进行诊断，来寻找可用于结直肠早期诊断简便、准确、无创的筛查方法。

1 脱落细胞筛查CRC的可行性

早在19世纪人们就观察到可以从结肠的刷洗液中找到脱落的肿瘤细胞用于结肠癌的筛查，后来组织学发现在结直肠癌组织及息肉邻近的黏膜面有丰富的脱落细胞及其碎片，而正常患者结直肠黏膜组织中脱落细胞的量则较少[9]。其机制为：正常的黏膜上皮细胞常在原位凋亡，然后被上皮下的巨噬细胞所吞噬；而结直肠癌细胞由于极强的增生能力及对失巢凋亡的抵抗，所以其黏膜层有大量的肿瘤脱落细胞存在[10]。研究[11]表明即使体积只有1 cm3的腺瘤，由于其展开面积是其体积的200倍左右，也可以从其排泄物中得到足够数量的脱落细胞或其细胞成分用于结直肠癌的筛查。酶联免疫吸附试验(ELISA)分析证实从粪便中分离得到的肿瘤脱落细胞几乎全部来源于结直肠[12]。以上事实表明：运用结直肠脱落细胞或其成分作为肿瘤标记物进行结直肠癌和腺瘤的筛查是可行的。

2 结直肠脱落细胞提取方法

2.1 从自然排出的粪便中提取脱落细胞1989年Albaugh等[13]创立离心淘洗法，并应用该方法从新鲜大便中提取到完整的结直肠脱落细胞，奠定了从自然排出的粪便中提取结直肠脱落细胞的试验基础。但该方法费时费力且需要昂贵的离心淘洗仪。1998年Loktionov等[14]应用免疫磁珠法(mgnetic activated cell sorting，MACS)从全大便的表面清洗液中获得了完整的结直肠癌脱落细胞并对其进行DNA定量分析，后续的研究表明该方法虽可以得到完整的结直肠脱落细胞，但细胞收集率较低。国内学者武子涛等[15]将液基薄层制片技术应用到粪便及清肠液脱落细胞的提取中，通过使用30、100、200目筛网集一体的细胞收集器和液基薄层自动制片技术从粪便中提取到脱落的结直肠肿瘤细胞并获得更加满意的制片效果。

从自然排出的粪便中提取脱落细胞的优点在于大便标本较易获取、操作无创、患者的依从性较好。但很多文献结果显示即使有丰富的结肠脱落细胞进入肠腔，由于厌氧的大便环境中含有胆汁酸和其他细胞毒性物质，所以从粪便中获得一定数量可用于结肠癌筛查的完整脱落细胞的可能性较小，尤其是从右半结肠脱落的肿瘤细胞。故目前关于粪便中脱落细胞的研究重要集中在检测粪便中脱落细胞裂解后的成分(如DNA、RNA、蛋白等)。

2.2 导泻清肠法采集大肠脱落细胞早在20世纪50年代就有报道[16]利用从大肠灌洗液中收集的脱落肿瘤细胞进行结直肠癌的筛查，但后来由于纤维结肠镜的出现而被人们忽略。因脱落细胞具有无创性、患者依从性好的优势，进入80年代后又开始被人们重新重视。Rosman等[17]采用清肠法显示脱落细胞对结直肠癌诊断的敏感性为93%，特异性为100%。武子涛等[18]通过反复试验发现口服平衡盐液后第3次和第4次收集的清肠液经处理后可获得满意的细胞学收集结果。

2.3 结肠镜冲洗液采集大肠脱落细胞在结肠镜直视下在取活检前对可疑病变部位进行冲洗，结肠镜检查结束后冲洗活检钳及结肠镜末端，同时收集整个结肠镜检查过程中的冲洗液，收集的液体经离心、固定等处理后，制成涂片或细胞块进行细胞学及其相关成分的检测[19]。

2.4 内镜直视下刷片在结肠镜直视下通过结肠镜细胞刷对可疑病变部位及其周围区域进行刷检，将刷子在玻片上快速滚动2～3次，然后用95%的酒精固定，制片后的刷子可在固定剂中搅动获取剩余的细胞以制成细胞块[19]。相对于内镜下活检，刷检细胞学的优势在于可在内镜直视下对可疑病变部位较大面积黏膜细胞进行诊断，可作为活检的重要补充手段，尤其对溃疡性结肠炎怀疑癌变患者。对于一些特殊患者，如长期口服抗凝剂活检时出血风险较高时，内镜下刷检细胞学检查也许是活检的一个很好代替。Brouwer等[20]对918例可疑结直肠患者进行内镜下细胞刷检，以手术或内镜下切除标本的病理结果为金标准，细胞学对结直肠癌诊断的敏感性为88.2%，特异性为94.1%，而内镜下活检诊断的敏感性为86.9%，特异性为99.5%，两者对结直肠癌诊断的敏感性差异无明显统计学意义。

2.5 直接从直肠黏膜收集脱落细胞Loktionov等[21]通过对结直肠癌患者手术切除的新鲜标本黏膜面进行分析，发现在癌症病灶的远侧黏膜面也存在脱落的肿瘤细胞，进而提出了脱落的肿瘤细胞沿黏膜面向远端迁移的假说并以这一理论为基础，设计了一种收集细胞的可充气装置，直接从467例可疑结直肠癌患者直肠的黏膜面收集脱落细胞并进行DNA含量的检测，结果显示对结直肠癌诊断的敏感性为91.3%，特异性为60%[22]。但研究显示该方法具有粪便污染率高的缺点，且这种收集方法还处于探索阶段，需要更多的相关研究证实。

3 结直肠脱落细胞及其相关生物标记物检测在CRC筛查中的研究现状及应用

3.1 结直肠癌的分子发病机制过去我们认为只有管状或管状绒毛状腺瘤性息肉才会癌变，即遵循腺瘤-结直肠癌的进展序列，目前的研究发现无蒂锯齿状息肉和传统的锯齿状息肉也会癌变，也就是说结直肠的癌变过程还有另外一个序贯(锯齿状息肉-结直肠癌)，且两者癌变过程中的分子机制是不同的[23]。腺瘤的癌变通常被APC基因的突变启动，绝大多数表现为染色体或倍体不稳定性(chromosome instability，CIN)。右半结肠锯齿状息肉的癌变表现为过度CpG岛甲基化的表观遗传学的不稳定性即CIMP；左半结肠锯齿状息肉的典型表现为微卫星的稳定性(MSS)和频繁的K-RAS基因突变，而CpG岛甲基化的程度则相对较轻[23]。根据分子改变的不同，目前结直肠癌可分为四个亚型：(1)染色体不稳定型；(2)微卫星不稳定型；(3)CpG岛甲基化型；(4)DNA总体低甲基化[24]。现阶段我们认为结直肠上皮的癌变由这些基因和表观遗传学的改变所启动，并进一步受到相邻组织肿瘤促进因素(如肠道菌群、炎症)所促进的过程[25]。随着对以上结直肠癌变过程中基因和表观遗传学改变的认识，人们尝试用DNA倍体、基因或表观遗传学改变的分子作为肿瘤标记物进行结直肠癌的早期诊断和预后分析。

3.2 大肠脱落细胞学检测

3.2.1 结直肠脱落肿瘤细胞标记物：从粪便中回收的脱落细胞数目较少，很难用细胞形态学标准来区分其良恶性，故人们尝试寻找可识别粪便样本中完整的结直肠脱落肿瘤细胞的分子标记物，如微小染色体维持蛋白(MCM)家族[26]。MCM是真核细胞在细胞周期中启动DNA复制的关键蛋白，它可以调控细胞由G1期进入S期，并限制DNA在每个细胞周期中只复制一次[27]。MCM只存在于处于细胞周期中的细胞(如结直肠肿瘤细胞)，但在静止或分化好的细胞中则低表达或不表达，故其可作为上皮细胞进展为肿瘤细胞的标志。Davies等[28]利用免疫组化法对40例结直肠癌和25名正常对照者粪便中的MCM进行检测，结果显示37例结直肠癌中有MCM阳性肿瘤细胞的存在，而所有正常对照者粪便中均未检测到MCM阳性的肿瘤细胞。

3.2.2 大肠脱落细胞DNA倍体分析：CIN是结直肠癌变过程中最常见的基因组不稳定性，约出现在85%的结直肠癌患者中[24]。通常我们通过流式细胞仪或图像分析仪两种方法检测出异倍体或多倍体来推断染色体的不稳定性[29]。Gerrits等[30]对大肠炎症性疾病合并结直肠癌患者DNA倍体的研究显示：DNA倍体异常(DI： 1.06～1.34，HR=4.7， 95%CI：2.7～7.9；DI>1.34，HR=5.0，95%CI：2.5～10.0)是大肠炎症性疾病患者癌变的重要危险因素，可用于结直肠癌的早期筛查。Dewhurst等[31]发现染色体分离错误和四倍体耐受可导致CIN的发生，进而促进癌变的进展，四倍体状态和CIN可作为结直肠癌预后差的指标。而倍体异常与结直肠癌患者预后的关系方面仍存在一定的争议，Walther等[32]通过对63项研究中的10 126例结直肠癌患者的倍体与预后情况做Meta分析，结果显示倍体异常的结直肠癌患者预后相对较差，应该和MSI状态一起用于所有的结直肠癌患者中。而其他研究结果则显示倍体异常与结直肠癌患者的预后无明显关系，目前不推荐DNA倍体应用于临床结直肠癌患者的预后分析中。

3.3 粪便中肿瘤脱落细胞成分检测大便标本由于操作无创、易获得和患者依从性较好的优点被认为是结直肠肿瘤筛查的理想标本，但由于其富含胆汁酸、细胞毒性物质等复杂成分，使得直接从大便标本获得完整的结直肠脱落细胞较为困难，在过去的十多年中，人们尝试利用脱落细胞裂解后的成分(如DNA、mRNA、microRNA、蛋白等)进行结直肠肿瘤的早期筛查，但到目前为止，只有粪便DNA检测方面的研究较为完整，并显示出较高的诊断敏感性和特异性。

3.3.1 基因分子标记物：与结直肠癌变相关的基因有很多，如APC、CTNNB1、KRAS、BRAF、SMAD4、TGFBR2、TP53、PIK3CA、ARID1A、SOX9、FAM123B、ERBB2等，它们主要通过干扰信号通路(如WNT)的功能或影响负责DNA修复或增殖基因的功能引起结直肠上皮细胞的癌变[33]。K-RAS基因：K-RAS是RAS基因家族的一员，其位于12号染色体短臂，负责编码调节增生和分化的鸟嘌呤核苷酸结合信号转导蛋白[34]。正常情况下K-RAS蛋白会水解GTP，从而抑制RAS蛋白，但突变的K-RAS蛋白可能会成为活跃的信号转导分子，使细胞增殖失控[35]。K-RAS是首次报道的粪便样本中可用于结直肠肿瘤诊断的突变基因[36]，然而后续的研究[37]显示K-RAS突变对结直肠肿瘤诊断的敏感性和特异性不高，其仅出现在约35%的结直肠癌中，也并非结直肠疾病所特有的，如胰腺增生性疾病等也可以出现K-RAS基因突变，甚至正常的结肠黏膜组织也可以检测到其存在[38]。然而由于K-RAS基因突变的位置相对固定，常位于基因的第12或13个密码子，相对于其他突变基因更易检测，故目前其仍常用于结直肠癌的分子筛查组合中。

TP53：P53蛋白能够识别DNA损伤、协助DNA修复并诱导细胞凋亡，而突变的TP53基因可影响细胞凋亡导致细胞增殖失控，进而导致癌变的发生。研究[39]显示突变的TP53基因可导致机体对染色体不稳的耐受性,进而加速异倍体细胞的癌变。故理论上检测到突变的TP53基因对恶性肿瘤的发生具有重要的提示作用，但后续的研究提示其并非结直肠肿瘤理想的标志物。Eguchi等[40]对25例结直肠癌患者粪便和配对组织标本中突变的TP53基因进行检测，结果显示突变TP53在两者中的阳性率仅28%和44%。其低敏感性可能与结直肠肿瘤患者TP53点突变的位点不恒定有关。

APC：APC基因位于染色体5q21-22，长约108 kb，其编码的APC蛋白在负性调控wnt/β-连环蛋白通路上起着关键作用。突变的APC蛋白不能下调和抑制WNT信号通路中的β连环蛋白，进而转录因子TCF4和下游的癌基因(如MYC)被不恰当地激活，导致结直肠肿瘤的发生[41]。在腺瘤-结直肠癌的序贯中，APC基因突变出现较早，可在大约60%的结直肠癌和腺瘤中检测到[42]。但突变可发生于该基因的前1 600个密码子的任何位置，且突变的类型也各不相同，这使得其作为标志物使用受限[43]。Traverso等[44]利用数字蛋白截断法对46例结直肠腺瘤患者和28名正常对照者进行APC突变基因检测，结果显示APC突变基因对结直肠腺瘤诊断的敏感性为57%。

但由于结直肠癌的DNA点突变具有异质型，即个体间突变的基因及位点不同，故单独应用基因突变组合来进行结直肠及息肉的筛查可能存在花费高、敏感性低的问题，目前基因突变常与表观遗传学分子标记物一起用于结直肠肿瘤的筛查试验中。

3.3.2 表观遗传学分子标记物：结直肠肿瘤表观遗传学相关的分子标记物主要分为MSI、L-DNA和甲基化三类。MSI：微卫星的不稳定性在遗传性的结直肠癌和腺瘤中更为明显，分别有90%和80%。位于错配修复基因MSH2内含子区域的BAT-26是MSI最常使用粪便标志物，研究[45]显示其对近端结直肠癌的单独诊断敏感性可达40%。

L-DNA：正常的结直肠上皮细胞凋亡时，其DNA会被核酸内切酶切割成大小约180～200个碱基对的小片段，而肿瘤细胞由于对失巢凋亡的抵制，其脱落的肿瘤细胞中DNA不被降解，长约1 800～2 400个碱基对，称为L-DNA[46]。故L-DNA可作为肿瘤细胞的标记用于结直肠癌的检测，研究[47]显示当以细胞内L-DNA含量25 ng为分界时，其对结直肠癌诊断的敏感性为79%，特异性为89%。

甲基化：如上所述甲基化在结直肠的癌变过程中起重要作用，其常发生负责调节细胞增生、凋亡和DNA修复的基因的启动子或者第一个非编码外显子区域[48]，相对于基因突变而言，由于其位置比较固定，故更适合作为结直肠癌筛查的分子标记物。Zou等[49]利用QUARTS技术，对37例结直肠癌、25例结直肠腺瘤患者和29名健康对照者组织中的4个甲基化基因(BMP3、NDRG4、VIM、TFPI2)进行检测，结果显示这4个甲基化基因联合对结直肠癌及腺瘤诊断的特异性为100%，敏感性分别为100%和96%。

3.3.3 分子诊断组合：由于单基因实验很难达到人们期望的诊断敏感性与特异性，所以在过去的20多年中，人们尝试了不同的基因与表观遗传学生物标记物组合用于结直肠癌及癌前病变的筛查，然而只有个别组合显示出较高的诊断敏感性与特异性。其中一个叫做MT-sDNA的组合表现出极好的诊断敏感性及特异性，是目前唯一通过美国FDA认证的结直肠癌及癌前病变分子筛选组合。一项对自动化的MT-sDNA实验评价的多中心研究[50]显示：2个甲基化基因(NDRG4、BMP3)、K-RAS突变和大便潜血分子组合对结直肠癌、>1 cm的进展期腺瘤和息肉诊断的敏感性分别为98%和57%，对腺瘤合并高级别非典型增生诊断的敏感性为83%，特异性为90%。另外一项涉及10 000例患者的大型横断面研究[51]显示：MT-sDNA对结直肠癌、进展期腺瘤和>1 cm的息肉诊断的敏感性分别为92%、42%和42%，特异性为87%。MT-sDNA的优点在于其有比FOBT实验更高的诊断敏感性，且已实现自动化，可满足现代化实验室高通量的需要。

4 结直肠脱落细胞及其标记物检测存在的问题及前景

CRC是最常见的恶性肿瘤之一，早期诊断可降低其发病率及死亡率，近年来利用结直肠癌变过程中基因和表观遗传学改变的分子作为肿瘤标记物进行结直肠肿瘤的诊断，表现出了较好的诊断敏感性及特异性，然而该方法还存在一定的不足。目前存在的问题：(1)尽管有丰富的大肠脱落细胞进入肠腔，但由于在富含胆汁酸和细胞毒性物质的复杂粪便环境中停留时间较长，很多脱落细胞被裂解，加之目前从粪便标本中收集细胞的方法，细胞收集率不高，故很难从粪便中回收到足够数量的可用于结直肠肿瘤筛查的完整脱落细胞，针对这一问题，尝试从清肠液、结肠镜冲洗液及结肠镜直视下刷检获取脱落细胞，由于细胞在肠道停留时间较短且所含粪便成分较少，得到完整脱落细胞几率可能会更大；(2)DNA倍体异常用于结直肠肿瘤的诊断、预后及耐药性的研究已经有二十年之久，但DNA倍体异常对于结直肠的诊断仍缺乏一个统一的标准，DNA异常倍体状态的形成及其在结直肠上皮细胞癌变过程中的具体机制仍不清楚，DNA倍体异常与结直肠肿瘤患者预后及耐药性的关系方面仍然存在一定的争议，需要更多的研究来深究；(3)由于大便中含有细菌DNA酶及PCR抑制剂，可能影响粪便基因检测的结果，故在提高粪便DNA提取及检测方法灵敏度的同时，要改进粪便标本的收集及处理方法，如收集后立即加入含乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液来抑制细菌DNA酶活性[52]；(4)现阶段较多的结直肠肿瘤分子标记物被人们提出，但大多实验诊断的效果还不理想，选择单基因还是联合分子诊断及联合诊断分子的种类、数目等问题亟待解决，需要我们通过大样本对其诊断敏感性及特异性进行评价，结合费用及诊断效率，选择更加适用于结直肠癌及癌前病变筛查的生物标记物组合；(5)与FOBT相比，现阶段基因检测的费用较高，对经济不发达地区人群来说仍是一笔不小的负担，也许随着相关分子标记物检测的产业化及检测技术的自动化，分子诊断的费用相应降低而被大多数人所接受；(6)大多分子诊断较为费时，且对检验人员有一定的要求，不过第二代商业化的分子诊断实验MT-sDNA已问世，基本可以实现自动化，可满足现代化实验室高通量的需求，便于其临床应用的推广；(7)对结直肠癌前病变诊断的敏感性相对较低；(8)选择分子诊断实验合适的筛查人群及复查间隔，FDA推荐50岁以上的无症状人群每3年应接受一次MT-sDNA结直肠肿瘤筛查实验，而合并有大肠炎症性疾病和有症状的人群则推荐接受结肠镜检查，分子诊断实验可能是其有益补充；(9)患者的依从性，研究[53]显示提高依从性本身比提高治疗对死亡率的影响更大，故需不断改进标本的收集方法、处理技术及检测方法，增加患者的依从性，如患者对无创、便于运输的粪便标本的依从性较好。

虽然目前仍存在以上这些问题，然而相对于FOBT及结肠镜检查而言，由于粪便分子学诊断具有操作无创、敏感性高等优点，结直肠脱落细胞及其成分标志物检测仍具有十分广阔的应用前景。很多有可能用于结直肠癌及癌前病变筛查的分子标记物已逐渐被人们发现，亟需从中筛选出最佳的标记物组合，尤其是对结直肠癌前病变(进展期腺瘤和息肉)更加敏感的标记物组合。进一步优化大便处理、保存、运输及基因检测的方法。进一步探讨和完善该方法对非典型增生、大肠炎症性疾病甚至其他消化道疾病(如胰腺增生性疾病)诊断的可能性。由于结直肠脱落细胞及其成分可反映出整个结直肠的信息，故结直肠脱落细胞及其生物标记物组合不但可用于无症状人群结直肠癌及其癌前病变的筛查，也可作为对高危患者进行结肠镜等检查的有益补充，并可在一定程度上降低结直肠镜随诊的频率。总之，大肠脱落细胞及其相关分子诊断实验可能成为大肠癌更为理想的筛查方法，但在实际临床应用中需对其不断优化，同时期望找到对结直肠肿瘤更加理想的筛查手段。

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(责任编辑：李 健)

Study of exfoliated cells and its markers in the screening of colorectal cancer

LI Yang, YU Xiaofang

Department of Hepatobiliary and Pancreas Surgery, Shenzhen People’s Hospital, the Second Clinical Medical College of Ji’nan University, Shenzhen 518020, China

Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies. Surgical treatment of malignancy is effective， and the resection rate will be improved if lesions could be detected by early diagnosis and screening. The predominant screening methods up to date included fecal occult blood test (FOBT), colonoscopy, Barium enema, CT; however, they are not the ideal screening methods for CRC. In recent years, as the deepening of understanding of the genetic and epigenetic landscape across colorectal neoplasms, detection of exfoliated cells and related molecular markers are carried out to find possible new screening tests for early cancers and pre-malignant adenomas to get low price, safety, accuracy and high patient compliance methods. This article reviewed the advantages and limitations of different exfoliated colonocyte collection techniques and andvances in the molecular marker screening assays.

Colorectal cancer; Exfoliated cells; Marker; Screening method

李阳，在读研究生，研究方向：普外科临床与基础研究。E-mail:1028168734@qq.com

余小舫，教授，博士生导师，主任医师，研究方向：普外科临床与基础研究。E-mail:yuxfshui@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.09.003

R735.3+4

A 文章编号：1006-5709(2016)09-0968-06

2016-05-23