rTMS对脑梗死大鼠记忆功能及海马IL-1的影响研究

张靖慧，方莹莹，李娜

重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)是一种新型的无痛无创脑刺激技术，临床研究发现磁刺激可改善正常受试者及脑卒中患者学习记忆功能[1]，提高恢复期脑卒中患者的运动学习技能，但其机制尚不明确。近年来大量研究表明白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)在低浓度条件下具有一定脑保护作用，参与海马依赖的学习记忆过程[2]，长时程增强(long-term potentiation，LTP)刺激可促进海马内IL-1β表达[3]。本研究应用脑梗死大鼠模型，观察rTMS对脑梗死后空间记忆功能以及海马区IL-1β mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 ①实验动物：健康成年雄性SPF级SD大鼠45只，体质量220.2g，购自南方医科大学实验动物中心。②试剂：Trizol：15596-018，Invitrogen；cDNA第一链合成试剂盒：#K1622，Fermentas；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)：#K0242，Fermentas；Ex TaqTM：DRR100A，TAKARA；DL2000 DNA Marker：D501A，TAKARA；DL15000 DNA Marker：D502A，TAKARA；引物合成：南京金斯瑞。③仪器：磁刺激治疗采用YRDCCY-Ⅰ型磁刺激仪(武汉依瑞德医疗设备新技术有限公司生产) ；Morris水迷宫实验采用水迷宫实验系统(中国医学科学院生产)；qRT-PCR使用illumina eco Real-Time PCR System测定。

1.2 方法 ①分组：将45只大鼠随机分为假手术组、对照组和rTMS组，每组15只。②造模：将对照组和rTMS组大鼠参照改良的Longa线栓法制作右侧大脑中动脉阻塞再灌注(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型[4-5]，脑缺血后90min将线栓拔出，完成造模。采用Bederson评分法观察大鼠清醒后行为学改变[6]。将1、2、3分动物纳入本实验。共29只大鼠制模成功并纳入本研究，实验过程中有3只死亡，最终对照组有12只、rTMS组有14只大鼠完成实验。假手术组线栓从颈总动脉分叉处进入颈内动脉约5mm，无病理行为学改变。③rTMS治疗：rTMS组大鼠从术后1d开始给予患侧大脑磁刺激治疗，采用YRDCCY-Ⅰ型磁刺激仪。将清醒状态下的大鼠固定在自制透明固定器中。8字形线圈(8字中心最大磁场强度1.8T)，隔着固定器(厚0.2mm)紧贴大鼠头皮，线圈中心位于大鼠梗死侧大脑上方[7]，刺激强度为120% 静息运动阈值(50%最大磁场强度)，刺激频率为10Hz，总刺激量为300脉冲，单序列30脉冲，共10个序列，中间间隔50s[8]，每次治疗8min。每天1次，连续5d。

1.3 评定标准 ①行为学检测：采用Morris水迷宫试验。模型制作的第3天开始，3组大鼠进行水迷宫实验，共5次，4d内完成，第1天训练2次。圆形平台固定放置于第三象限中心，放入适量水使平台低于水平面3cm。前4次为训练，每次分别从3个象限(除平台所在象限)的中点将大鼠逐一面向池壁放入水中，设定大鼠在平台上停留3s为找到平台，记录大鼠在水中寻找并爬上平台的时间，即逃避潜伏期。如果大鼠在60s内未找到平台，则将其引导至平台，停留20s以熟悉环境，此时逃避潜伏期记为60s。最后一次为检测，撤去平台，于第1象限入水点处将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠60s内第一次穿过平台的搜索时间(逃避潜伏期)。将最后一次成绩进行统计分析，以此来评价大鼠的空间学习记忆能力。②实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测大鼠海马IL-1β mRNA表达情况：术后6d使用ABI StepOne Plus测定。并观察梗死灶(皮层、纹状体)IL-1βmRNA表达情况。同时检测炎症相关因子：诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)。qRT-PCR内参为：肌动蛋白(β-Actin)。

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试 与假手术组相比，对照组及rTMS 组大鼠的逃避潜伏期均显著延长(P<0.01)，而rTMS组较对照组的逃避潜伏期则明显缩短(P<0.05)，见表1。

2.2 qRT-PCR结果 对照组、rTMS组IL-1β mRNA在患侧海马及皮层的表达量均较假手术组增高(P<0.01)，rTMS组在患侧海马的IL-1β mRNA表达较对照组显著增高(P<0.01)，在患侧皮层中rTMS组IL-1β mRNA表达较对照组无明显变化。检测患侧海马iNOS、TNFβ mRNA以明确炎症反应水平，结果提示对照组、rTMS组iNOS、TNFβ mRNA表达量均较假手术组增高(P<0.01)，rTMS组较对照组有所下降，但无显著差异。见表2。

表1 rTMS对脑梗死大鼠空间学习记忆功能的影响 分，

与假手术组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.05

组别nIL⁃1βmRNA患侧海马患侧皮层患侧海马区iNOSTNF⁃α假手术组151111对照组 121．82±0．48a3．34±0．51a3．15±0．27a1．59±0．18arTMS组146．14±1．05ab4．61±0．93a2．66±0．37a1．46±0．07a

与假手术组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.05

3 讨论

本研究通过Morris水迷宫实验观察rTMS对空间学习记忆功能的影响，结果发现，对照组大鼠逃避潜伏期较假手术组明显延长，rTMS组大鼠逃避潜伏期较对照组明显缩短，说明rTMS一定程度上改善脑梗死大鼠空间学习记忆功能。

IL-1是一种经典炎性细胞因子，存在α、β两种异构体，主要合成部位是海马，生理情况下，IL-1及IL-1mRNA在脑内含量很低，并且以IL-1β为主。正常生理状态下，IL-1β对记忆固化起重要作用，参与海马依赖的学习记忆过程。生理状态下低浓度IL-1β可协同IL-6，促进神经生长因子释放、新血管形成、胶质增生，从而增强神经细胞抗缺血能力和促进修复作用[9]。条件性恐惧实验或者LTP刺激后大鼠海马区IL-1βmRNA表达增加[3,10]，腹腔注射小剂量IL-1β可促进大鼠躲避记忆和条件性恐惧记忆能力[11]。急性脑梗死引起IL-1β浓度病理性增高，成为一种内源性致热源，在炎症和急性期反应中发挥作用，参与神经损伤，促进炎症反应，扩大脑梗死面积。脑梗死后IL-1β表达具有一定时间依赖性，动物研究表明， IL-1β mRNA在脑梗死后6h开始增高，12h～3d达到高峰，随后逐渐下降至正常水平[12]，本研究中脑梗死后6d梗死灶与患侧海马区IL-1βmRNA表达水平仍高于假手术组，与文献报道基本一致[12]。本研究于脑梗死急性期(MCAO术后1d)给予rTMS治疗，结果显示rTMS促进患侧海马区IL-1β mRNA表达增加，对梗死灶IL-1β mRNA表达无明显改变，提示其具有部位特异性，而且rTMS不影响其它炎症因子(iNOS、TNF-α)表达，提示rTMS对炎症反应无增强作用。其具体机制尚不明确，但初步提示了海马区IL-1β浓度改变在脑梗死后学习记忆功能恢复过程中可能起到重要作用。此外rTMS为脉冲样刺激模式，一般认为其作用机制与突触可塑性相关。rTMS对神经的调控作用有明显的频率依赖性，高频(>1Hz)rTMS对神经兴奋性的调控表现为类似LTP作用。LTP刺激可促进大鼠海马区IL-1βmRNA表达增加[3,10]，根据本研究结果推测rTMS可能通过影响海马区IL-1β以改善脑梗死后空间记忆功能。

本研究使用的磁刺激线圈刺激面积较大，无法实现精确靶向刺激患侧海马区。研究表明空间学习记忆功能需要完整的神经网路参与，在空间导航过程中，海马是主要参与部位，而在回忆过程中，除了海马，还需要海马旁皮层的参与，海马旁皮层包括内外侧前额叶、楔前叶、后扣带回、压后皮层以及内外侧颞叶区[13]。最新研究发现皮层下内侧隔/斜角带核的GABA能神经元的突触与海马神经元形成链接[14]，从细胞层面上证实了海马与皮层间存在神经网络。本研究结果提示患侧大脑在磁刺激后海马区IL-1βmRNA表达增高，可能是海马神经元受到磁刺激直接作用的结果，亦可能是磁刺激促进整个学习记忆神经网络重建的结果，其具体机制需进一步研究证实。

综上所述，本研究表明急性期脑梗死行rTMS治疗可促进空间学习记忆功能恢复，其作用机制可能与rTMS增加患侧海马区IL-1βmRNA表达相关，为进一步探索rTMS治疗脑卒中最佳治疗方案提供有力基础依据。

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