荧光素酶报告基因法测定飞灰中二噁英类物质*

籍龙杰 陆胜勇# 杜颖哲 陈 彤 李晓东 严建华黄俊卿 Masafumi Nakamura Hiroshi Murata

(1.浙江大学能源清洁利用国家重点实验室，热能工程研究所，浙江 杭州 310027；2.株式会社日吉，日本 近江八幡市523-0806)

二噁英是一类具有相似化学结构、理化性质及生物效应的多氯代三环芳香族有毒化合物[1-2]。根据分子中氯原子的取代位置和数目不同，该类化合物包括75种多氯代二苯并-对二噁英(PCDDs)、135种多氯代二苯并呋喃(PCDFs)[3]。另据世界卫生组织规定，209种多氯联苯(PCBs)满足以下条件可连同二噁英统称为二噁英类：(1)结构上与PCDDs/PCDFs(简写PCDD/Fs)类似；(2)可以与芳香烃受体连接；(3)产生生物化学毒性；(4)在食物链中富集不易降解[4]。近年来，二噁英类化合物引起的毒性效应得到人们的普遍关注，包括免疫毒性、发育和生殖毒性、神经毒性和致癌性以及持续的生物累积行为和能力[5-6]。其中，PCDD/Fs在环境中含量少但是毒性大，PCBs在一些被污染的地方含量大，但是毒性较小。另外，多环芳烃(PAHs)由于较易分解，虽然不满足二噁英类物质的定义，但是相关研究表明，PAHs可以结合到芳香烃受体(AhR)上，具有潜在的致毒性[7]。

然而，二噁英并不是目标产物，它们是由含碳、氧、氢和氯的物质通过加热反应过程产生的副产物。这些化合物的最主要产生源头为废弃物焚烧，尤其在烟气冷却阶段会产生大量的二噁英[8-10]。例如，ALCOCK等[11]研究表明，英国全国PCDD/Fs年排放量大约为560～1 100 g I-TEQ，而生活垃圾焚烧贡献了总PCDD/Fs毒性当量排放浓度(排放到大气环境)的30%～50%。值得注意的是，焚烧炉空气净化装置中收集的飞灰可以认为是环境中PCDD/Fs的主要排放源。ABAD等[12]提出西班牙一座生活垃圾焚烧炉在1998—1999年期间8次分析检测中，烟气、飞灰和底灰中二噁英的平衡质量分数分别为0.095%～0.315%、69.89%～97.47%、8.31%～29.79%。此外，根据我国PCDD/Fs排放清单，2004年废弃物焚烧通过灰渣形式排放的PCDD/Fs为1 147 g I-TEQ，而通过烟气排放为610.5 g I-TEQ。另外，根据《生活垃圾填埋场污染控制标准》(GB 16889—2008)的要求，生活垃圾焚烧飞灰经处理后二噁英低于3 μg TEQ/kg之后方可进入生活垃圾填埋场处置，否则，以危险废弃物对待。因此，评估废弃物焚烧炉产生的飞灰中二噁英类化合物的含量和分布状况有助于选择合理的处置方式，掌握相应的污染情况。

2010年，九部委联合发文《关于加强二噁英污染防治的指导意见》指出，所在地环保部门应对废弃物焚烧装置排放情况每两个月开展1次监督性监测，对二噁英的监督性监测应至少每年开展1次，这个指导意见将进一步导致需要进行二噁英检测分析样品的大量激增。目前，二噁英分析的常用方法是高分辨气相色谱/质谱(HRGC/HRMS)分析技术，它是国际上通用的标准方法[13]。但是，仪器分析时间较长，花费较高，而且操作较为复杂。所以，发展一种快速、便宜和可靠的分析筛选样品中二噁英含量的方法是十分必要的。化学活化荧光素酶报告基因法(CALUX)，即CALUX生物检测法，作为一种更加快速和便宜的检测方法可以为所有AhR活性提供综合检测，并且可以进行风险评估，所以该方法可以作为仪器分析方法的替代选择，目前也已被某些发达国家作为标准方法并进行相关介质的二噁英筛查。然而，不同国家的垃圾特性不一，尤其是我国垃圾分类机制尚未健全，垃圾含水量大且组分复杂，燃烧飞灰中的二噁英分布特性与其他国家存在一定差异。目前，我国也正在组织国内的生物检测实验室对该方法进行对比验证，力图在2016年出台《固体废物 二噁英类的筛查报告基因法》等相关国家标准。此标准的建立可以满足飞灰等固体废物中二噁英的筛查测定，有效利用成本较低的检测方法，实现快速地为环境管理提供服务和技术支持，为推动CALUX生物检测法在我国的发展以及为确立国家标准法提供相应的实验技术和数据基础。

研究二噁英类生物检测法的主要目的是简化二噁英类分析流程，并找出快速检测的结果与HRGC/HRMS结果之间的换算系数，从而可以利用快速检测的结果和换算系数来推算 HRGC/HRMS 的结果。通过对来自垃圾焚烧厂的飞灰样品(样本数n=42)同时进行HRGC/HRMS与CALUX检测，测定两种方法的相关性和转换系数。结果显示，两种方法检测的实验结果之间相关性很强，CALUX生物检测法可以作为HRGC/HRMS的替代方法并予以推广。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 二噁英分析前处理试剂

丙酮、甲苯、正己烷和二氯甲烷购自日本J.T.Baker公司；Celite助滤剂硅藻土和硅胶购自西格玛奥迪里奇公司；盐酸、无水乙醇、次氯酸钠和无水硫酸钠为国产；1%(质量分数) XCARB/celite购自美国XDS公司；用于HRGC/HRMS分析的分散硅胶活性炭购自日本关东化学株式会社；二噁英标准样品购自剑桥同位素实验室。

2,3,7,8-四氯代二苯并二噁英(2,3,7,8-TCDD)标准样品，购自美国Cerilliant公司；99.5%(质量分数)二甲基亚砜制剂(DMSO)，购自日本和光纯药公司；荧光素酶分析系统(荧光素酶试剂)和细胞培养细胞溶解溶剂，购自美国普洛麦格公司；胰蛋白酶溶液、磷酸缓冲溶液(PBS)和细胞培养液(包括RPMI 1640培养液，8%(质量分数)胎牛血清和1%(质量分数)青霉素-链霉素双抗溶剂)，购自美国生命技术公司；H1L6.1c2细胞系(小鼠肝癌细胞重组细胞)，购自美国XDS公司；细胞培养、测定、分析用96孔板(Costar 3610)，购自美国康宁公司。

42个飞灰样品分别取自中国不同地区的生活垃圾焚烧炉、工业垃圾焚烧炉和医疗垃圾焚烧炉。

1.2 实验过程

1.2.1 HRGC/HRMS检测法

分析过程严格按照《固体废物 二噁英类的测定 同位素稀释高分辨气相色谱—高分辨质谱法》(HJ 77.3—2008)标准进行，利用日本JEOL公司的JMS-800D型HRGC/HRMS进行检测。利用HRGC/HRMS测定的PCDD/Fs浓度定义为“I-TEQ”。

1.2.2 CALUX生物检测法

首先，飞灰样品经酸泡、过滤后分别进行液液萃取和索氏提取，将萃取后溶液和索提溶液混合后旋转蒸发浓缩至1～2 mL。利用33%(质量分数)硫酸硅胶柱和活性炭柱组成的二连柱进行精制。淋洗液经真空离心浓缩仪浓缩后用正己烷定容至4 mL以备荧光测定。进行荧光检测时，首先确定稀释倍数。然后向13 mL试管中加入4 μL DMSO并取相应量的样品加入试管中，浓缩至正己烷完全挥发，加入400 μL RPMI 1640培养液混合均匀。取出已经播种H1L6.1c2细胞的96孔板，移除培养液后，每孔加入190 μL混合液。再次培养20～24 h后，利用化学发光酶标仪(Berthold Centro LB 960,德国)，结合荧光基质溶液，测定荧光发光量，通过发光度计算 PCDD/Fs浓度。利用CALUX生物检测法测定的PCDD/Fs浓度定义为“CALUX-TEQ”。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的制作

用标准溶液制作标准曲线后，根据此标准曲线计算样品的浓度。将DMSO配制的11个梯度浓度的2,3,7,8-TCDD标准溶液(STD 0至STD 11)，按照CALUX方法操作，得出相对发光单位(RLU)，RLU定义为样品中的二噁英与基质反应后发光，发光强度经化学发光酶标仪检测后所呈现出的数值。带入表1中一系列理论式，得到的标准曲线见图1。

图1 2,3,7,8-TCDD浓度—应答曲线Fig.1 Dose-response curve of 2,3,7,8-TCDD standard solution

2.2 标准曲线的核实

标准曲线的灵敏度变化管理是十分重要的，必须进行确认，并记录。CALUX生物检测方法利用在每个96孔盘的标准溶液区域加入DMSO、不同浓度的标准溶液和质量控制(QC)标准溶液控制检测结果的准确性和可靠性。因为STD 5为STD 0至STD 11中间浓度的标准物质，其发光量大约位于每次试验标准曲线的中部定量区域，而QC标准溶液也为已知浓度的标准溶液。为核实定量操作是否被准确进行，使用管理限界μ±2σ(μ为算术平均值，σ为测定量的标准偏差)，对标准曲线进行核实。由STD 5(2,3,7,8-TCDD质量浓度7.81 pg/mL)以及QC标准溶液的测定值，求出测定量(毒性当量)，记录并保存在休哈特控制图(见图2)上，两个控制图都利用西部电气公司编制的统计质量控制手册推荐的判定规则来检测控制图的非随机性模式[14]。

(2)化探异常特标志：区内金矿化均在化探异常范围，化探分散流及次生晕Ag、Au、Pb、Zn、Sb等元素综合异常区是找矿的有利部位。

表1 2,3,7,8-TCDD标准溶液测定值及变换值

注：1)指96孔板上每个孔里含有的2,3,7,8-TCDD的质量；2)B=A/190×1 000；3)C=ln(B×100)。

注：平均值用μ表示，警告值用μ+σ表示。图2 STD 5和QC标准溶液的质量控制图Fig.2 Quality control chart of STD 5 and QC standard solution

标准溶液B/(pg·mL-1)μ/(pg·mL-1)σ/(pg·mL-1)C.V./%偏离度/%备注STD0250.00257.00173.0067.502.80STD1125.00189.00106.0056.0051.20STD262.5062.2011.6018.600.48定量上限STD331.3031.005.5417.900.96STD415.6015.501.006.430.64STD57.817.820.344.330.13STD63.914.170.276.396.65STD71.952.300.3013.1017.95定量下限STD89.77×10-10.970.2626.800.72检出下限STD94.88×10-1STD102.44×10-1

通过控制图的处置基准，根据管理限界μ±2σ的脱离状况做如下规定：即仅有1点超出管理限界，也要在究明原因并进行改善的同时，进行再测定，对进行改善所采取的措施以及再测定的结果进行记录；而且，即使在管理限界内，与基准值相比，如果有一定的离脱倾向或者连续有偏离的测定值的情况下，也要究明原因，根据情况，在进行改善的同时进行再测定。

图2中共有50个96孔盘的STD 5和QC标准溶液的数据，50个96孔盘数值基本都控制在警告值以内，其中STD 5和QC标准的平均值分别为7.76、2.89 pg/mL，它们的警告限值分别为7.23～8.31、2.12～3.66 pg/mL，符合西部电气公司编制的统计质量控制手册中的判定准则。

2.3 检出下限以及定量范围

利用2.1节中DMSO配制的11个浓度梯度的2,3,7,8-TCDD标准溶液进一步确定CALUX方法的检出下限以及定量范围。对于所配制的用来计算检出下限的标准溶液，每个浓度的标准溶液都要进行n≥5的测定，并定量计算测定值(毒性等价量)的μ、σ以及变异系数(C.V.)，制作精度管理图，从表2得出检出下限以及定量范围。

针对由标准物质浓度的定量值所获得的变异系数(n=5)，规定30%以下的最小浓度值为检出下限(0.977 pg/mL)，20%以下为定量范围，其范围内的最小浓度值为定量下限值(1.95 pg/mL)，定量范围为1.95～62.50 pg/mL(STD 7至STD 2)。对于标准物质的检出下限以及定量范围，至少要每隔6个月进行1次确认，查看其是否发生变化。还有，当测定条件发生大幅度改变时(机器、试剂或者设施等发生变化以及测定负责人发生变化等)也要进行确认。

2.4 实际飞灰样品的分析检测

实验得到42个飞灰样品分别进行HRGC/HRMS检测和CALUX检测的二噁英浓度，两者的相关性见图3。

由HRGC/HRMS测得的结果为0.003～12.904 ng TEQ/g(平均值为2.260 ng TEQ/g)，而CALUX测得的数据为0.019～25.170 ng TEQ/g(平均值为5.670 ng TEQ/g)，说明CALUX检测范围比较宽且满足日本规定的CALUX方法对飞灰等固体样品定量下线为1 ng TEQ/g的要求。同时，CALUX结果高于HRGC/HRMS所测得的结果1.5～5.6倍(平均值为3.01倍)，表明所有CALUX值均高于HRGC/HRMS测定值。另外，由图3看出，两者线性相关性很高(R=0.96)，证实CALUX生物检测方法可以作为测定飞灰样品中PCDD/Fs浓度的一种可选筛选方法或者半定量检测方法。CALUX-TEQ较高可以归因于以下几个原因：(1)毒性当量因子(I-TEF)与CALUX相对效能(REP)值之间的差异。对比I-TEF和REP值(见表3)的大小，发现PCDFs的REP值明显高于I-TEF，若将HRGC/HRMS测得的PCDD/Fs同系物浓度与相对应的REP相乘得到的毒性当量值将明显高于与I-TEF相乘得到的结果。这可能是由于CALUX对PCDFs的反应效应更高，使得CALUX-TEQ的结果高于HRGC/HRMS的计算结果。(2)CALUX-TEQ中包含的同系物浓度中存在一些无毒同系物，尽管其浓度值没有包含于I-TEQ，但是也可能活化AhR和荧光素酶，使得RLU增加，导致CALUX的测量结果进一步升高。(3)CALUX中存在其他AhR配体可以激发芳香烃受体和荧光素酶活性，但是在HRGC/HRMS分析中没有定量测定，这些化合物包括其余高持久性污染物，例如溴代二噁英(PBDD/Fs)、多溴联苯(PBBs)、多卤代二噁英和呋喃(PXDD/Fs，X=Cl/Br)和一些多氯化萘(PCNs)同系物；低持久性污染物，例如PAHs；以及一些自然化合物[15]。一些研究也表明，某些PBDD/Fs甚至比对应的PCDD/Fs毒性相似甚至更强。

图3 两种方法检测灰渣中二噁英类物质结果的相关性Fig.3 Correlation between the values obtained from the CALUX and HRGC/HRMS

根据我国42个飞灰样品的结果，得到的由CALUX-TEQ预测HRGC/HRMS检测结果的换算系数为0.332。该结果高于日本规定的飞灰样品的换算系数(0.318)，这在一定程度上说明我国飞灰样品具有区别于日本的飞灰样品的特征。另外，周志广等[16]在利用此方法测定烟气中二噁英类物质时得到的换算系数为0.379，说明不同介质之间，换算系数也会有所不同。在我国实际应用时，需要具体考虑。

表3 HRGC/HRMS与CALUX检测方法毒性当量因子的对比

日本规定生物检测法测定值换算后只要介于HRGC/HRMS测定值的0.5～2.0倍就被认为有效。所检测的42个飞灰样品中，当飞灰中的二噁英浓度较低时，两者间比值(CALUX/HRGC—HRMS)往往低于0.5,这可能是由于二噁英浓度过低的样品中其他有机污染物的存在容易对实验结果产生影响。因而，在处理低浓度样品时要格外小心。

3 结 论

通过对比CALUX生物检测法和HRGC/HRMS法对我国飞灰样品的检测数据，得出了两者的换算系数。结果表明，两者存在很强的相关性(R=0.96)。证实CALUX生物检测方法可以作为确定飞灰样品中PCDD/Fs浓度的可选筛选方法或者半定量检测方法。不过，由于样品的差异，操作环境的区别，不同的国家换算系数可能存在差异。而且，在不同介质之间，换算系数也不同。如果增加样品数量，适当修正换算系数，使其具有更普遍的适应性，将会更有利于推广CALUX生物检测法在中国检测PCDD/Fs浓度方面的应用。

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