一株抗汞真菌的分离纯化及其对含汞废水治理特性的研究*

赵盛开 张梅华 潘利祥 孙 璐 朱 彤,3 王昕竑 蒋继宏 王立辉 姜朵朵 于 松

(1.中国石油大学(北京)化学工程学院，北京 102249；2.中节能集团六合天融环保科技有限公司，北京 100085；3.清华大学环境科学与工程系，北京 100084；4.江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116)

汞在常温下呈液态，具有较强的毒性，是一种重要的工业原料，在有色金属冶炼、造纸、电子工业、农药生产等诸多领域都有着广泛的应用。每年有大量的汞污染物以废水、废气、废渣的形式进入水体、大气及土壤中，排入环境中的汞污染物经过物理化学及生物作用形成各种形态的汞。汞污染物难以用一般的生化方法进行降解处理，因此可在自然环境中长期存在，并通过食物链等方式进入生物体内，危及人类健康[1]。

目前，工业废水除汞的方法主要有化学沉淀法、金属还原法、活性炭吸附法、电解法、离子交换法和微生物法等[2-4]。其中，微生物法因成本低、生物污泥产量少、操作pH及温度范围宽、吸附性及选择性高等成为最具发展前景的含汞废水处理方法，特别在处理Hg2+质量浓度为1～100 mg/L的含汞废水时表现出良好的处理效果[5]。陈宏伟[6]利用从污染物中分离出的假单胞菌(Pseudomonassp.)处理Hg2+质量浓度为30 mg/L的含汞废水，24 h后Hg2+的去除率高达91.7%。WAGNER DÖBLER等[7]利用7种耐汞假单胞菌，在700 L的生物反应器中处理电解废水(Hg2+质量浓度为3～10 mg/L)，10 h后Hg2+的去除率可以达到95%～99%。SHARIAT等[8]利用产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)处理2.5 mg/L的甲基汞溶液，24 h后甲基汞的去除率达到60%。此外，还有学者利用基因工程菌[9-10]、混合菌[11]等处理含汞废水。

本研究从被汞污染的土壤中分离筛选出抗汞真菌，通过内转录间隔区(ITS)序列比对进行菌株的系统分类鉴定，并对其处理含汞废水的特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

在重庆万山地区受汞矿污染的表层土(0～10 cm)中采集土壤样品用于分离抗汞真菌。

1.2 菌种筛选及分离纯化

将采集的土壤样品用采样袋密封保存带回实验室。取10 g新鲜土壤样品装入含有90 mL无菌水的三角瓶中，用玻璃珠打散搅匀，制成土壤悬液。将悬液涂布在含Hg2+20.00 mg/L的AY固体培养基(无水醋酸钠0.246 1 g/L，酵母提取物0.15 g/L，琼脂15 g/L，氯霉素25 mg/L，pH=7)平板[12-13]上，室温条件培养，观察真菌菌株的生长情况。挑选单个真菌菌株接入新鲜的含Hg2+20.00 mg/L的AY固体培养基平板上进行纯化。

1.3 菌悬液制备

将上述分离纯化的菌株接种至扩大液体培养基(葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaCl20.1 g/L，KCl 0.1 g/L,MgSO40.25 g/L,FeSO40.005 g/L，pH=7)[14]中，在25 ℃、130 r/min下摇床培养3 d，然后在11 000 r/min下离心5 min,取离心后的菌液作为生物吸附菌悬液，4 ℃下保藏备用。

1.4 菌种鉴定

采用真菌基因组提取试剂盒提取菌株的DNA，利用真菌通用引物ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTG ATATGC)进行ITS rRNA基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增。温度程序为：95 ℃预加热3 min，然后在95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，重复30个循环。PCR产物直接用于碱基序列测定。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站的BLAST进行碱基序列的比对，确定菌株的系统分类。

1.5 影响因素分析

由于反应时间、Hg2+初始浓度、pH、菌剂投加量对Hg2+的生物吸附有较大影响，配置HgCl2溶液50 mL，对每个影响因素均设置5组梯度实验，在25 ℃、180 r/min下振荡反应，反应结束后静置12 h，测定每组溶液中Hg2+含量，计算Hg2+的去除率。

1.6 菌株的微观表征

配制两份100 mL的AY液体培养基(其他配方与AY固体培养基相同，不含琼脂)，其中一份培养基中含Hg2+20.00 mg/L，另一份不含Hg2+，将分离出的菌株接种到两份AY液体培养基中，室温条件下静置培养10 d。培养结束后将培养基中混合物于11 000 r/min下离心5 min，收集沉淀物(即湿菌体)。将湿菌体清洗、固定、脱水、干燥、黏托、表面金属镀膜等处理后，进行扫描电镜观察，研究菌体吸附Hg2+前后的形态变化。

2 结果与讨论

2.1 分离菌株的系统分类

经分离、扩大培养、驯化、筛选后，从受汞矿污染的土壤样品中分离得到一株对Hg2+具有较强耐受性的真菌菌株，命名为GX-4。通过ITS序列比对，对GX-4进行了系统分类鉴定，发现GX-4与尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)同源性达到99%，属半知菌类，从梗孢目，瘤座孢科，镰刀菌属。尖孢镰刀菌对重金属废水具有较好的吸附去除效果，VELMURUGAN等[15]利用镰刀菌(Fusariumspp.)治理含Zn2+废水，Zn2+去除率达到30%～60%；SU等[16]利用FusariumoxysporumCZ-8F1治理含砷废水，也取得了良好的效果。

2.2 反应时间的影响

制备5组Hg2+初始质量浓度为20.00 mg/L的HgCl2溶液50 mL，调节溶液pH为5，向每组溶液中投加2.0 g GX-4菌悬液，反应时间分别设定为30、60、120、240、360 min，考察不同反应时间下GX-4对Hg2+的吸附去除效果，结果见图1。

由图1可见，当反应时间从30 min延长到60 min时，Hg2+的去除率显著提高，反应60 min时，Hg2+的去除率即可达到93.14%，随着反应时间的继续延长，Hg2+的去除率提高缓慢，反应进行360min后，Hg2+的去除率仅提高到94.90%。OZSOY[17]利用寡孢根霉菌(Rhizopusoligosporus)及WU等[18]利用黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporim)处理含汞废水时也发现了相似的变化趋势。可见，微生物对Hg2+的吸附去除主要经历两个阶段：第1阶段是快速的表面吸附阶段；第2阶段是缓慢的胞内扩散阶段[19]。真菌对Hg2+表现出良好的吸附去除效果，这是因为真菌细胞壁上存在一系列的功能基团，如氨基基团、羧基基团、磷酸盐基团等,这些基团能够提供负电荷成为Hg2+的有效靶位点[20-21]，被吸附在这些靶位点上的Hg2+与配合物以及电子相互交换，经过一段时间后，Hg2+通过被还原或者被固定从而有效去除。

图1 反应时间对Hg2+去除率的影响

2.3 Hg2+初始浓度的影响

配置5组HgCl2溶液50 mL，调节溶液中Hg2+初始质量浓度分别为0.50、5.00、10.00、20.00、50.00 mg/L，溶液pH为5，向每组溶液中投加2.0 g GX-4菌悬液，振荡反应360 min，考察Hg2+初始质量浓度对Hg2+去除率的影响，结果见图2。

图2 Hg2+初始质量浓度对Hg2+去除率的影响

由图2可见，随着Hg2+初始浓度的增加，Hg2+去除率呈现出较大的波动变化，这是因为真菌细胞壁上的靶位点数相对固定，当Hg2+初始质量浓度小于10.00 mg/L时，这些靶位点没有被充分激活，此时Hg2+去除率随着Hg2+初始浓度的增加而降低；当Hg2+初始质量浓度为10.00～20.00 mg/L时，细胞壁上的靶位点被逐渐激活，Hg2+去除效率随着Hg2+初始浓度的增加而升高；由于菌剂投加量有限，当Hg2+初始质量浓度超过20.00 mg/L时，没有足够的靶位点吸附Hg2+[22]，去除率又开始呈现下降趋势。当Hg2+初始质量浓度为0.50 mg/L时，Hg2+去除率高达94.80%，出水Hg2+降至0.03 mg/L以下，满足《污水综合排放标准》(GB 8978—1996)的限值要求(<0.05 mg/L)[23]。因此，对于Hg2+初始质量浓度超过0.50 mg/L的含汞废水可以采用多级处理方式，以满足废水达标排放的要求。

2.4 pH的影响

制备5组Hg2+初始质量浓度为20.00 mg/L的HgCl2溶液50 mL，调节溶液pH分别为3、4、5、6、7，向每组溶液中投加2.0 g GX-4菌悬液，反应360 min，考察不同pH下GX-4对Hg2+的吸附去除效果，结果见图3。

图3 pH对Hg2+去除率的影响

由图3可见，pH可以显著影响GX-4对Hg2+的吸附去除效果，这是因为pH能够影响金属离子的化学形态，调整溶液中氢离子的浓度，进而改变真菌细胞壁上靶位点的化学性质，影响Hg2+的去除率[24]。当溶液pH为5时，Hg2+的去除率最高，为95.35%，可能是低pH条件下真菌细胞壁上靶位点的质子化作用阻止了其对重金属的吸附，随着pH的增加，去质子化作用使得靶位点上的负电荷增多，从而更容易吸附Hg2+ [25]。DAS等[26]也研究了pH对Hg2+去除率的影响，认为真菌处理含汞废水中的最适pH为5～7。

2.5 GX-4菌悬液投加量的影响

制备5组Hg2+初始质量浓度为20.00 mg/L的HgCl2溶液50 mL，调节溶液pH为5，向溶液中分别投加0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 g GX-4菌悬液，振荡反应360 min，考察不同投加量下GX-4对Hg2+的吸附去除效果，结果见图4。

图4 GX-4菌悬液投加量对Hg2+去除率的影响

由图4可见，当GX-4菌悬液投加量为0.5～1.0 g时，Hg2+的去除率显著提高，当GX-4菌悬液投加量为1.0 g时，Hg2+去除率最大，为94.55%。这是因为随着GX-4菌悬液投加量的增加，真菌细胞壁上提供的靶位点总数增加，更多的Hg2+被吸附，使Hg2+去除率迅速增加。当GX-4菌悬液投加量为2.0～5.0 g时，Hg2+去除率明显下降，继续增加GX-4菌悬液投加量至10.0 g时，Hg2+去除率基本稳定在91%左右。可见，GX-4菌悬液的最佳投加量在1.0～2.0 g。分析原因，可能是过多的菌剂可能阻碍了靶位点的暴露，反而不利于真菌对Hg2+的吸附去除[27]。

2.6 GX-4的微观表征

吸附Hg2+前后GX-4菌体的微观形态变化见图5。由图5(a)可见，在不含Hg2+的AY液体培养基中培养10 d后，GX-4菌体表面较为光滑，而在含Hg2+的AY液体培养基中培养10 d后，菌体表面较为粗糙，有颗粒附着，这与胡晓婧等[28]利用平菇菌糠吸附废水中Cu2+的扫描电镜结果类似。经检测，图5(b)中GX-4菌体表面的颗粒状物体为Hg2+离子，进一步证明了GX-4可以有效吸附Hg2+的表面特性。此外，菌体周围有明显的沉淀物，推断GX-4在含汞条件下产生某类生物酶，催化Hg2+发生沉淀反应，从而固定Hg2+[29]。

图5 吸附Hg2+前后GX-4的微观形态

3 结论和建议

从汞污染土壤中分离纯化出一株抗汞真菌菌株GX-4，经基因测序鉴定，该菌属于尖孢镰刀菌。利用GX-4处理含汞废水，发现30～60 min为GX-4对Hg2+的快速吸附阶段，在处理Hg2+初始质量浓度低于0.50 mg/L的含汞废水时，出水Hg2+能够达到GB 8978—1996的排放限值要求；GX-4菌悬液的最佳投加量为1.0～2.0 g，最佳反应pH为5。

对吸附Hg2+后的GX-4进行扫描电镜观察，发现该菌能将吸附的Hg2+转化成稳定的沉淀物。利用真菌治理重金属污染的微生物技术具有绿色环保、无二次污染、成本低廉等优点，本研究发现的抗汞真菌菌株可用作生物反应器的活性组分，未来具有广阔的应用前景。

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