氦氖激光对退变颞下颌关节BMP-2表达的影响

毛凯平，邹璟，李解，姜梦雅，高桃珍

颞下颌关节骨关节病(temporomandibular joint osteoarthrosis, TMJOA)是指颞下颌关节组织发生磨损与变形，并在关节表面形成新骨的非炎症性骨关节病。由于颞下颌关节结构与功能复杂，加之人的一生中牙合型不断发生改变，颞下颌关节经历了复杂的改建过程，以致其发病率高达30%，严重影响患者的生活质量[1]。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解、组织改建是TMJOA最重要的病理改变。文献证实，基质调节因子通过影响细胞外基质降解及合成导致基质成分紊乱及功能改变，在TMJOA发生与发展中起着主要作用[2-7]。氦氖激光是临床治疗TMJOA的常用手段之一，但其作用机制尚不完全清楚，本研究通过观察氦氖激光对退变颞下颌关节细胞外基质基质调节因子骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表达的影响，以期明确氦氖激光对颞下颌关节退变的保护作用与机制，为临床运用氦氖激光治疗颞下颌关节骨关节病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 ①实验动物：选用骨骼发育成熟的健康成年雄性新西兰大白兔40只，月龄5～6个月，体质量2～2.5kg，无牙颌畸形，由武汉大学实验动物中心提供(合格证号42000500002225)。②主要试剂： 羊抗兔BMP-2单克隆抗体(武汉博士德生物公司，货号：BA0585)、鼠抗羊二抗(KPL公司)。③主要材料与仪器：PVDF膜(Millipore 公司)、氦氖激光多功能治疗仪(MDC-500)。

1.2 方法 ①分组与处理：在标准条件下(武汉市第一医院中心实验室)适应性饲养3周后开始实验，实验过程中的程序经过了武汉市第一医院实验动物伦理委员会审批。所有动物进行编号，查随机数字表分为4组各10只。正常组，自然饲养，不作任何治疗；模型组，模型，不作任何治疗；假模型组，同模型组，但不切除关节盘，不作任何治疗；治疗组，于造模后第1d开始氦氖激光治疗，连续治疗10d。各组分别在造模后第1天和11天两个时间点各取5只，将实验动物以过量注射麻醉药方法处死，取各组髁突，直接冻存于-80℃冰箱待检测。②造模：参照常嘉等[8]的造模方法，建立颞下颌关节骨关节病动物模型。于耳缘静脉注射1mg/kg的2.5g/L的戊巴比妥钠。无菌条件下自眼外眦外侧5mm处至外耳道方向行2cm长的皮肤切口，分离皮下组织，暴露关节囊。水平切开关节囊，切开关节盘的外侧附着，将下颌升支推向外侧以充分暴露髁突关节面与关节盘。将关节盘前外二分之一部分切除。无菌生理盐水充分冲洗后将剩余关节盘复位，分层缝合关节囊、皮下组织和皮肤。假模型组仅作关节囊切开后即缝合组织。术后不限制动物的下颌运动，饲养颗粒性常规兔饲料，单笼饲养。连续肌肉注射青霉素3天，每天4万单位。于术后1个月行颞下颌关节CT检查，出现典型的TMJOA改变即进行后续实验，未出现TMJOA改变的动物予以剔除。③治疗方法：采用氦氖激光多功能治疗仪(MDC-500)，输出氦氖激光波长632.8nm，功率10mw，激光光针光斑直径2mm。取患侧颊车、上关、下关、听宫、翳风，光针紧贴皮肤并与之垂直，每穴照射5min，共治疗10d。

1.3 评定标准 Western Blot方法进行检测BMP-2蛋白表达量：按蛋白分子量配制10%的PAGE胶电泳，根据预染marker显示，充分分离目的蛋白，取出凝胶用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。然后用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。再加入一抗孵育，TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，用封闭液稀释相应的HRP标记二抗——1:40000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，显色曝光。BandScan凝胶图像分析软件分析胶片灰度值。

2 结果

2.1 模型兔颞下颌关节CT表现 模型兔于术后1个月行三维CT检查，显示关节软骨逐渐消耗、丧失，出现缺损，关节软骨表面粗糙，光泽度变差，髁突形态改建、软骨层增厚明显，患侧髁突外观肥大，见图1A～C。

图1A～C A和B分别为模型组健侧(左侧)、患侧(右侧)颞下颌关节三维CT表现，图C为CT平扫，可见患侧髁突形态明显改变、软骨层增厚明显，髁突肥大。

2.2 氦氖激光治疗对BMP-2表达的影响 Western blot检测显示，正常组和假模型组各时间点BMP-2蛋白表达均无显著性变化；造模成功后第1d时间点，模型组与氦氖激光组BMP-2蛋白表达均明显减少，经过氦氖激光治疗10d后，BMP-2蛋白表达较第1d及模型组明显上升(P<0.05)。见图2，表1。

图2 各组不同时间点BMP-2蛋白表达

组别1d11d正常组 11.010±0.125假模型组 1.066±0.1910.982±0.096模型组 0.574±0.122a0.532±0.133a氦氖激光组0.506±0.074a0.736±0.081b

与正常组比较，aP<0.05; 与模型组及氦氖激光组第1d比较，bP<0.05

3 讨论

尽管颞下颌骨关节病的机制尚未完全阐明，但髁突软骨细胞对基质合成与降解代谢调控的失衡被认为是其主要病理环节[9]。文献证实，髁突软骨细胞是颞下颌骨关节软骨基质成分的惟一来源，颞下颌骨关节病的发生即为髁突软骨细胞所控制的合成、降解代谢失衡所致，其主要特征为关节软骨细胞外基质成分的进行性降解，同时伴随着继发性炎症因子的释放及其相关效应[9]。

临床研究表明，氦氖激光对颞下颌骨关节病具有良好的治疗作用[10]，其作用机制值得进一步深入研究。已有研究显示，氦氖激光光针释放出的激光光子能量被病态的生物分子吸收后，可改变病态生物分子内能，这种改变相当于一种刺激源，可直接或间接兴奋神经、肌肉和腺体，同时，可使钾离子致解反应时间显著延长，使五羟色胺物质明显降低，激活内源性吗啡样镇痛物质，延长感觉神经潜伏时间，整合中枢神经的痛觉信号，从而达到镇痛效果，并通过促进新生血管的形成改善颞下颌关节患者局部血液循环，通过抑制固有炎症介质PGE的合成及直接抗炎作用，降低炎症反应[11]。

BMP-2作为细胞外基质调节因子，同时也是合成代谢酶，可促进细胞外基质合成，并能诱导未分化的间质细胞不可逆的分化为软骨细胞和成骨细胞。对骨组织的发生、损伤和修复都具有重要作用。其对骨原细胞的分化起着决定性作用，是促进成骨的主要因子，可在骨损伤局部和异位促进细胞增殖，提高其碱性磷酸酶活性，是唯一能够单独在异位诱导成骨形成的分子。这使其在骨关节病的临床治疗中具有极大的潜在应用价值[12-13]。

综上所述，退变的颞下颌关节组织中，BMP-2蛋白表达较正常颞下颌关节明显降低，证实了BMP-2蛋白表达下降所致ECM合成减少是颞下颌关节骨关节病的机制之一。正常组与假模型组之间二者的表达无显著性差异，说明未切除关节盘的颞下颌关节模型无明显的退变。选用氦氖激光照射患侧颊车、上关、下关、听宫、翳风穴10d后，颞下颌关节组织中BMP-2蛋白表达明显增加，表明氦氖激光治疗可上调退变颞下颌关节细胞外基质BMP-2蛋白表达，促进细胞外基质合成，从而防治颞下颌关节骨关节病。本研究为临床运用氦氖激光治疗TMJOA提供了一定的理论依据，但氦氖激光影响相关蛋白表达的具体机制仍需进一步研究。

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