益生菌及益生元调节骨代谢的研究进展

于　婧，　夏永军，　王光强，　熊智强，　艾连中

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093



益生菌及益生元调节骨代谢的研究进展

于婧，夏永军，王光强，熊智强，艾连中*

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093

摘要：骨质疏松症已成为威胁中老年人健康的主要疾病之一，越来越多的人受到该病症的危害。肠道菌群是定殖在机体肠道内，与宿主形成共生关系的微生物，对宿主的免疫及代谢等产生重要影响，研究发现，肠道菌群与骨代谢之间存在密切关系，本文从肠道菌群与免疫、骨代谢与免疫、肠道菌群与骨代谢、益生菌及益生元调节骨代谢等几个方面阐述，肠道菌群有望成为骨质疏松症治疗的一个新靶点，通过益生菌或益生元来干预肠道菌群组成，进而调节免疫系统状态，抑制促炎因子的生成，从而降低骨吸收作用，达到预防和治疗骨质疏松症的目的。

关键词：益生菌； 益生元； 肠道菌群； 骨代谢； 骨质疏松症

骨质疏松症是一种常见的骨骼疾病，它由多种原因引起，且随着年龄的增长和社会老龄化，越来越多的人受到骨质疏松症的危害。1885年Pommer首先提出骨质疏松症一词，意为骨质减少的一种疾病。1955年Sissions更明确指出：骨质疏松症是骨支持组织含量减少，但矿物质成分仍保持于高水平的一种骨内结构的改变[1]。骨质疏松症临床分型为：原发性、继发性和特发性。原发性骨质疏松症是随着年龄的增长发生的一种生理性退行性病变，主要表现为绝经后骨质疏松症(高转换型)和老年性骨质疏松症(低转换型)；继发性骨质疏松症是由代谢性疾病或长期服用某些药物等一些因素所诱发，诱发因素有甲状腺功能亢进或降低、肢端肥大症、糖尿病等；特发性骨质疏松症多见于8～14岁的青少年，多伴有遗传家族史，女性多于男性，主要表现为青少年骨质疏松症和妇女妊娠、哺乳期骨质疏松症[1]。在美国，50岁以上妇女有三分之一确诊为骨质疏松症患者，平均每年有1.5亿人患上骨质疏松症。预计2020年，超过半数的美国人将遭受骨质疏松症的危害[2]。该病症已成为威胁中老年人及绝经期妇女的主要疾病之一[3]。骨质疏松症最大的危害是骨质疏松性骨折，据统计，50%女性与20%男性在他们的一生中，至少并发一次骨质疏松性骨折。该病症的发病是由20～30岁时所达到的骨量峰值以及随年龄增长而发生的骨丢失两方面因素决定的。人体骨量峰值50%～85%是由遗传决定，而环境因素在随年龄增长而发生的骨量减少中起到更加重要的作用[4]。

健康人和动物的胃肠道内定植着种类和数量繁多的微生物，这些微生物统称为肠道菌群[5]。通常，肠道菌群与宿主、外界环境形成一个动态平衡，与宿主的生长发育、物质代谢、衰老等有密切关系。特定组成的肠道菌群可以通过多种途径促进宿主的机体健康，主要具备以下功能：营养作用、提高防御能力、延缓衰老、抑肿瘤作用等。据报道，肠道菌群可利用氨基酸分解的NH2合成蛋白质或其他氨基酸，同时他们具有利用非蛋白氮合成氨基酸、蛋白质的生物固氮能力[6]。由此可见，肠道菌群的种类与数量对于机体健康具有重要作用。

1肠道微生物与骨代谢

1.1肠道微生物与免疫

肠道菌群成分与年龄息息相关，0～3岁的儿童，由于饮食、肠道感染、抗生素使用、母乳喂养等因素，菌群结构不断改变，机体免疫力迅速成熟[7]。3岁以后，菌群的多样性基本与成年人相似。当机体老龄化(>65岁)，肠道免疫力下降，菌群成分易受环境影响而变化[8-9]。微生物在肠道中大量定殖的同时，也作为大量的潜在抗原，它们与宿主形成相对稳定的共生关系，帮助机体进行消化吸收并抵抗病原体的入侵，宿主则为肠道菌群提供生存环境[10]。然而，在宿主处于病理状态时，饮食的改变，抗生素的使用以及病原体的侵入等都将改变肠道菌群结构，从而导致免疫力下降和代谢紊乱，引起一系列疾病发生，包括白色念珠菌性肠炎、食物过敏、湿疹、哮喘、糖尿病、代谢综合症等[4,11-12]。

无菌动物模型通常用来研究肠道菌群对机体的免疫、代谢、疾病等问题。研究表明，无菌小鼠的CD4+T细胞、肿瘤坏死因子α(TNFα)、破骨细胞前体细胞(CD4+/GR1-)显著少于常规条件小鼠。有趣的是，将常规条件小鼠结肠内容物转移给无菌小鼠后，CD4+T细胞、TNFα、CD4+/GR1-等指标均高于先前的水平。由于结肠内容物含有大量微生物，作为抗原引起机体内T细胞的增多，进而导致肿瘤坏死因子TNFα增加等一系列免疫反应[13-14]。此外，无菌动物的黏膜免疫系统发育不健全，肠道相关的淋巴组织发育不完全，动物脾脏T细胞与生发中心明显减少，由此表明，肠道菌群对于机体免疫系统有重要作用[4]。克罗恩病是一种与肠道菌群结构改变相关的炎症性疾病，可侵犯肠系膜和局部淋巴结，在胃肠道任何部位均可发病，主要发生于末端回肠和右半结肠。Willing等人[4,15]将一对患有克罗恩病的同卵双胞胎作为实验对象，其中一人处于克罗恩病活跃期，另一人处于克罗恩病缓解期。研究发现，与正常菌群结构相比，克罗恩病患者肠道内侵染性大肠杆菌量显著增加，而具有抗炎作用的柔嫩梭菌明显减少，说明肠道中抗炎菌株的比例与肠道疾病息息相关。对克罗恩患者的粪便进行分析，在克罗恩病活跃期，机体内的有益菌双岐杆菌量显著下降，而在缓解期则逐渐恢复到正常水平。

1.2骨代谢与免疫

骨的功能是为肌肉收缩提供附着处及保护内脏等重要的生命器官，一般认为，骨在细胞水平上是不活跃的，事实上骨细胞在不停地进行着细胞代谢，有两种细胞在骨代谢中起着重要的作用，一种是吸收骨基质的破骨细胞，另一种是合成骨基质的成骨细胞[16]。二者分布在骨膜、骨小梁及骨皮质处。成骨细胞起源于多能的间充质干细胞，破骨细胞则由有造血功能的骨髓单核细胞分化而来，单核细胞是破骨细胞、巨噬细胞和树突状细胞的共同前体细胞，局部微环境影响着单核细胞的分化方向[4]，在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)存在的情况下，能够增加破骨细胞的增殖和存活，并且提高细胞中核因子κB受体因子(RANK)的表达量，抑制核因子κB受体活化因子(RANKL)，从而促进破骨细胞的形成[17]。在成骨细胞和破骨细胞相互作用的部位被称作为基本多细胞单位。在每一个基本多细胞单位，骨可因破骨细胞的吸收而消失，也能被重新合成骨的成骨细胞所取代。

对于骨量丢失与免疫的关系，已有研究指出诸如类风湿性关节炎等一些自身免疫疾病引起的骨量降低，是由于T淋巴细胞释放的炎症因子导致的[18]。绝经后雌激素缺乏引发的炎症因子分泌增多，能够加大破骨细胞的形成并延长其存活时间[19]。曾有研究表明，轻度炎症会影响到骨转换过程并可能导致骨质疏松症，例如，血清中超敏C-反应蛋白的升高与骨吸收增加、骨密度减少、骨折风险增加等密切相关[20]。肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1(IL-1)阻滞治疗可以降低绝经后早期妇女骨吸收标志物的水平[21]。除此之外，对于T细胞缺乏小鼠，以抗CD4抗体、抗CD8抗体治疗，能够预防卵巢摘除引起的骨量丢失[22]。因此，骨髓中T细胞的形成以及T细胞释放的细胞因子增多能够引起破骨细胞骨吸收作用增强，当骨转换失衡后，骨量随之丢失甚至引发骨质疏松症[4,23]。

1.3肠道菌群与骨代谢

近年来，尽管有少数人致力于研究微生物调节骨代谢，但大多数人还没有意识到肠道菌群与骨健康关系密切，并且益生菌可以作为治疗手段来改善骨代谢。迄今为止，已有研究指出，微生物可以通过以下三个方面来影响骨骼健康：(1)矿物质吸收(钙和磷等)，(2)免疫调节，(3)释放小分子物质(血清素、雌激素类似物等)[14]。Sjogren等[13]提出，肠道菌群缺乏的无菌小鼠股骨远端骨体积分数比常规条件小鼠增加39%，骨小梁数目增多，骨小梁间距减小，皮质骨骨量也有显著增高。通过骨髓培养发现，无菌小鼠的破骨细胞数目减少，CD4+T细胞和破骨细胞前体细胞(CD11b+/Gr1-)形成量显著减少。然而骨形成速率并没有显著变化[15]。Li等人[24]发现，肠道菌群缺乏小鼠股骨远端及椎骨的松质骨体积与皮质骨体积较正常小鼠均有增高，与Sjogren等人的结论相似。由此表明，无菌小鼠骨量增加是由于骨吸收速率降低，破骨细胞生成被抑制。除此之外，无菌小鼠骨骼中溶骨性细胞因子白介素6(IL-6)和TNFα的mRNA表达量明显减少，所以，无菌小鼠破骨细胞生成的减少有可能是通过免疫调节实现的[13]。该研究还指出，将无菌小鼠饲养在常规条件下，其肠道内种植了正常的肠道菌群，骨量便会降低到正常水平，CD4+T细胞和破骨细胞前体细胞生成速率也会增加到正常水平，这表明，无菌小鼠骨量高于常规条件小鼠是由于没有肠道菌群作为抗原，进而血液及淋巴组织中CD4+T细胞数量少于常规条件小鼠，所以骨髓中CD4+T细胞形成率降低。进一步论证骨密度的增加与骨骼中炎症因子的表达及破骨细胞生成减少密切相关[15]。

此外，可能存在其他机制影响骨代谢，但可以排除肠道菌群通过调节钙吸收来增加骨密度这个因素，因为无菌小鼠的血清钙和钙调激素的水平与常规条件小鼠相比无显著性差异[13]。另有研究表明，肠源性血清素能够抑制骨形成，减少骨量[25]。在无菌小鼠实验里，血液中血清素的确减少，但是给无菌小鼠种植正常菌群后小鼠骨量增加，但血液中血清素水平没有显著变化，这表明，无菌小鼠骨量增高不是由血液中血清素直接影响的。因此，我们认为无菌小鼠骨量的改变不是一个单一的过程，而是通过肠道菌群及免疫调节共同实现的。

2益生菌、益生元对骨代谢的调节

2.1益生菌对骨代谢的调节

益生菌(Probiotic)起源于希腊语，其意思是“专管生命(pro life)”。益生菌概念最早起始于1965年Lily DM[26]首先建议益生菌是指对动物肠道菌群平衡有益的促进物质或微生物。1989年Fuller R[27]将其修改为：“益生菌是补充喂养的具有活性的微生物，而且可通过改善肠道菌群的平衡，对宿主动物产生良好的健康效应”。尽管此定义当时仅指动物，但仍为大多数医学文章所引用[6]。现如今，益生菌的定义为“一类对宿主有益的活性微生物，是定植于机体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡[28]、发挥有益作用的活性有益微生物的总称”[29]。目前，我国食品用微生物菌种主要有：植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、双歧杆菌属、德式乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种、发酵乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热链球菌等[30]。从最近市场看，新菌种的引进是必然趋势。随着人们生活节奏的加快，越来越多人开始注重养生，益生菌产品之所以备受青睐，与其对机体的保健功能密不可分，其本身具有调节肠道微生态、促进营养成分在肠道的消化吸收、降低血清中的胆固醇含量、缓解高血压以及抗肿瘤作用。近年来，益生菌的添加范围越来越广，除了酸奶、奶酪等传统乳制品之外，牙膏、冰激凌、啤酒等均有添加益生菌的产品实例[14]。已有很多学者针对各种疾病，研究益生菌如何改善机体健康状况，揭示其作用机理，其中益生菌对骨代谢的调节属于新兴领域，目前已经获得一些研究成果。

在家禽类动物方面，已有研究证实，以枯草芽孢杆菌喂食母鸡，能显著提高母鸡产蛋性能以及蛋壳品质，并明显提高鸡胫骨灰分含量以及骨密度[31]。除此之外，将地衣形芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌共同喂食肉鸡，可以增大其胫骨厚度[32]。另有学者进行了以下研究，分别以枯草芽孢杆菌喂食感染了肠炎沙门氏菌和未感染该致病菌的雏鸡，测定雏鸡胫骨灰分含量及钙含量，发现枯草芽孢杆菌可以预防肠炎沙门氏菌感染导致的骨量降低[33]。该研究还证实，雏鸡比成年鸡对于枯草芽孢杆菌的调控更加灵敏。因此，我们认为以枯草芽孢杆菌为主的益生菌对于蛋鸡和肉鸡的骨骼健康有益。

益生菌还作为一种辅助治疗剂，应用于治疗牙周炎引起的牙槽骨骨量减少，据研究，通过丝线结扎大鼠双侧上颚第一磨牙的方法构建牙周炎模型，并口服枯草芽孢杆菌治疗该病症，发现枯草芽孢杆菌可以降低牙周炎引起的牙槽骨骨量减少[34]，并且治疗效果与丝线结扎强度有关，结扎强度越弱，益生菌治疗效果越好[35]。对于该种病症，口服酿酒酵母也可减少牙槽骨骨量丢失，降低促炎症因子TNFα和白介素1β并增加抗炎症因子白介素10的分泌[36]。另有研究表明，以长双歧杆菌的西兰花发酵液喂食大鼠，可以预防由高脂饲料引起的破骨细胞活性增强[37]。因此，我们认为益生菌对于牙周炎模型以及高脂模型导致的骨量丢失或破骨细胞活性增强，有较好的预防作用。

罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475是一种人源罗伊氏乳杆菌，能够抑制人单核细胞系THP-1产生肿瘤坏死因子，可通过单核吞噬细胞系统来刺激免疫调节反应，进而不同程度地减轻人类肠道炎症[38]。McCabe等[39]提出，罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475可通过抑制肿瘤坏死因子的产生而降低骨吸收，有趣的是，该益生菌改善骨代谢的功效与性别相关。雄性小鼠的股骨及椎骨的骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度等均有改善，然而雌性小鼠却没有显著性变化。尽管在其他领域性别特异性并不少见，但罗伊氏乳杆菌对于骨骼参数影响的性别相关性十分有趣，仍需深入研究进而揭示其作用机制。Britton等人[40]发现，在雌激素缺乏的条件下，罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475能够显著降低绝经后去卵巢小鼠的骨量丢失，并且骨吸收标志物、以及破骨细胞的生成均明显降低。由此表明，罗伊氏乳杆菌对于雌激素缺乏条件下的骨骼健康具有关键作用。

Ohlsson等[41]提出，以副干酪乳杆菌DSM13434喂食去卵巢小鼠，6周后与没有进行益生菌干预的去卵巢小鼠相比，皮质骨骨量增加，骨吸收标志物I型胶原C端肽以及尿钙均显著降低，此外，益生菌的干预能够降低两种炎症因子TNFα和IL-1β的表达，并增加破骨细胞抑制因子护骨素的表达量。因此，我们认为益生菌可能是通过免疫调节来实现改善骨代谢的。

除了在家禽与啮齿类动物方面，Avella等人[42]提出鼠李糖乳杆菌可以促进斑马鱼的脊骨钙化，其作用机制是鼠李糖乳杆菌可以由MAPK1/3通路调控骨细胞的生成[43]。

2.2益生元对骨代谢的调节

益生元是一类不易消化的食品配料，但可作为原料被肠道菌群利用，能选择性促进肠道内一种或几种细菌生长或增加活性，对宿主健康有益[44]。益生元能刺激利用糖类细菌(包括双歧杆菌和乳酸菌)的生长和活性，促进有机酸的释放。有机酸可降低肠道pH值，形成抗菌环境，抑制肠道病原体的生长。益生元包含一大类非消化寡糖，常见的有菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、异麦芽低聚糖、大豆低聚糖、焦糊精和乳果糖等，天然存在于许多高纤维食物中，包括某些水果、蔬菜和谷物。由于益生元的优良品性，已被广泛应用于日常保健及食品添加等行业[45]。

在近二十年来，许多研究表明益生元具有促进矿物质元素吸收的作用。将GOS/FOS以9∶1加入常钙饲料及低钙饲料中，能够增加骨矿化作用及骨密度，并增加钙、磷、镁等元素的吸收[46]。以葡聚糖喂食雌性大鼠4周，可以显著增加其钙、镁元素吸收量[47]。以一种新型益生元龙舌兰果糖喂食去卵巢小鼠，血钙及骨钙含量均高于假手术组[48]。FOS及双果糖酐III可促进胃切除大鼠的钙元素吸收[49]。此外，Weave等人[50]发现，低聚半乳糖能够增加肠道中双歧杆菌的比例并提高大鼠骨量。Whisner等[51]提出，青少年女性摄入低聚半乳糖3周后，钙吸收量增大，肠道菌群中双歧杆菌的比例增高，这与Weave等人得出的结论相符。Abrams等人[52]发现，青少年在持续摄入长短链混合的菊粉型果聚糖一年后，骨密度比未摄入组高47%，该研究者提出，骨密度增加是由于菊粉型果聚糖提高了钙吸收，但是并没有对肠道菌群组成以及对免疫系统的调节进行研究。

3结论与展望

肠道菌群可以调节机体的代谢和免疫状态，近年来，无菌小鼠实验证明了肠道菌群是骨量的一个重要调节因子，通过免疫系统来影响破骨细胞的生成，从而达到调节骨代谢的目的。为了进一步证明，肠道菌群与骨量之间的关系，研究者采用益生菌、益生元等可以影响肠道菌群组成的因素干预宿主，发现能够不同程度的促进机体骨量增加以及各类骨指标的改善。除此之外，研究者采用了骨量增加较快的青春期模型以及骨转换较高的绝经后模型或去卵巢模型，发现益生菌可以有效增加青春期模型的骨量，以及显著降低高骨转换所带来的骨量丢失。益生菌还可以通过抑制促炎因子TNFα、IL-1、IL-6的分泌，并促进抗炎因子IL-10的分泌来降低骨吸收作用，从而预防骨量丢失。因此，肠道菌群对骨质疏松症的治疗可能是一个新靶点，仍需大量研究者从事有关肠道菌群与骨代谢之间的研究来提供更多实验依据。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.011

基金项目：国家自然科学基金面上项目(31371809)；国家农业科技成果转化资金项目(2013GB2C000153)。

作者简介：于婧(1992～)，女，硕士研究生；研究方向：微生物。 E-mail: joyceyu26@126.com。 *通讯作者：艾连中，男，教授。E-mail: ailianzhong@163.com。

Research advance in role of probiotics and prebiotics in regulation of bone metabolism

YU Jing, XIA Yong-jun, WANG Guang-qiang, XIONG Zhi-qiang, AI Lian-zhong

School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai, 200093, China

AbstractOsteoporosis is one of the serious diseases to damage more and more middle-aged and older people. The gut microbiota, the commensal bacteria living in our intestine, has a significant effect on immunity and metabolism of the host. According to the reported, there was a close connection between gut microbiota and bone metabolic profile. In this article, the following several aspects such as gut microbiota and immune, bone metabolism and immune, gut microbiota and bone metabolism, and the effects of probiotics and prebiotics on bone mineral density were expounded, including the possible role for the gut microbiota in the regulation of bone mass via immune system, regulating osteoclastogenesis in turn. The gut microbiota might be a novel therapeutic target for osteoporosis and the fracture prevention was proposed.

Key wordsprobiotics; prebiotics; gut microbiota; bone metabolism; osteoporosis