治疗性HBV DNA疫苗的研究及进展

刘娟

治疗性HBV DNA疫苗的研究及进展

刘娟

HBV DNA疫苗是通过向体内递送编码HBV抗原的外源性重组质粒，刺激机体产生特异的体液免疫反应和细胞免疫反应，由于其能较好的诱发Th1型细胞介导的细胞毒反应，而且同蛋白质疫苗相比设计相对简单，生产高纯度产品所需成本更低，因此DNA疫苗成为对慢性乙肝进行免疫治疗的一种选择，它不仅可作为预防性疫苗，也可作为治疗性疫苗，在乙型肝炎预防和治疗中具有广阔的应用前景。

慢性乙型病毒性肝炎；DNA疫苗；免疫反应

全世界约有2.4亿例慢性乙型肝炎（简称乙肝）病毒（HBV）慢性携带者[1]。我国属于HBV感染的高流行区，乙肝表面抗原检出率约10%，其中慢性乙型肝炎患者约3千万人。对此类患者目前公认有效的药物包括干扰素和核苷酸类似物，但前者有效率仅为10%～30%且不良反应大，后者疗效短暂并易产生耐药，故常导致患者病情迁延不愈，每年有65万患者死于肝衰竭、肝硬化、肝癌[2]。尽管利用计划免疫控制乙肝已成为世界各国的共识，然而在接种乙肝疫苗的健康人群中约有5%～10%的人表现为对疫苗抗原的无应答或弱应答[3]，不能产生保护力水平的抗体。因此，研制新的疫苗或药物去抑制和消除HBV，降低肝脏失代偿、肝硬化和肝癌发病率成为目前急需解决的问题。1993年，Mancini等[4]报道HBV DNA疫苗免疫的HBV Tg小鼠血清HBsAg滴度明显下降或完全清除，发现乙肝DNA疫苗在诱导机体体液免疫和细胞免疫反应的优势后，HBV-DNA疫苗就作为一种针对慢性乙肝的具有潜力的免疫治疗手段被广泛研究。

1 HBV DNA疫苗的作用机制及治疗依据

HBV DNA疫苗接种机体后目的基因的表达产物系内源性抗原，激发体液、细胞免疫机制而达到防治乙型肝炎的目的。

DNA疫苗（质粒）在注射部位被细胞摄取后通过转录翻译生成蛋白质，蛋白质通过胞内处理后．把信息递呈给I类MHC限制性CD8+T细胞，表达I类MHC分子或共刺激分子。摄取质粒的细胞能分泌释放抗原，刺激B细胞生成抗体。同时抗原被

APC细胞（抗原递呈细胞）摄取，通过Ⅱ类MHC分子，递呈给

CD4+T细胞和B细胞，识别病毒感染的细胞。在此过程CTL（细胞毒性T淋巴细胞）介导细胞免疫对病毒感染预防起着重要的作用[4]。CTL能识别细胞表面的病毒蛋白，通过感染细胞的细胞溶解机制和通过细胞因子非细胞溶解机制来完成。CTL能针对病毒抗原决定簇产生交叉反应，故能针对不同细胞株而产生较强保护作用[5]。研究证实，发生乙肝慢性化的主要原因是慢性患者CTL反应低下，而治疗慢性乙肝的根本在于提高针对

HBV的特异性细胞免疫水平，激活特异性CTL，并使其长期维持，清除慢性感染患者体内的HBV[6]，打破对HBV的免疫耐受。Webster等[7]发现在不损伤肝细胞的情况下，CTL通过细胞接触和释放细胞因子激活细胞自身抗病毒机制也可达到清除HBV DNA核壳蛋白和DNA复制中间体的目的，这一发现为治疗性HBV DNA疫苗的应用进一步提供了依据。

2 抗原编码基因的选择

HBsAg含有诱导机体产生HBV中和抗体的抗原决定簇，可以很快诱导出体液和细胞免疫反应，是首选目的基因。前S2抗原中存在T细胞激活表位，免疫原性强，与S抗原联用能够提高机体对HBsAg的抗体应答水平，克服亚单位疫苗无应答现象。

HbcAg/HBeAg基因是HBV DNA疫苗的另一重要基因。HBcAg是具有高度免疫原性的人类T细胞抗原，可以诱导出MHC I类限制性CTL反应。胞内HbeAg前体与HBcAg有70%的共同序列，可以通过MHC I类、Ⅱ类抗原路径被CD4+T细胞识别，胞内共表达HBeAg会使受染肝细胞更易被HBeAg/ HBcAg特异性T细胞发现[8]。

3 DNA疫苗的导入

DNA疫苗在小型实验动物体内有较强的诱发免疫反应的潜力，但在大多数大型实验动物中免疫反应较为缓和并且短暂，这可能与转入的质粒基因表达水平较低有关。关于DNA疫苗体内导入的研究发展很快，从最初的直接肌肉注射到基因枪接种，再发展到近几年出现的电穿孔技术，质粒DNA的体内递送效率显著提高，其中电穿孔导入技术利用电离使细胞膜上出现短时的多个孔道以增加质粒的导入量，而且还造成了细胞因子的表达上调和炎细胞浸润，从而促进免疫系统的激活，它因兼备高效、安全、操作简便和低成本等多项特质[9-10]，成为DNA疫苗导入的首选方案。

4 DNA疫苗的动物实验

1996年Mancini等发现，单次HBsAg DNA免疫HBV转基因（Tg）小鼠，其外周血中HBsAg颗粒完全消失并持续5个月以上，肝组织中HBV mRNA的表达下降，脾细胞过继转移试验证实这一作用是由CD4+Th1细胞和CD8+CTL共同介导的，表明DNA疫苗诱导的CTL免疫应答对清除体内持续性病毒感染有疗效[11]。

Kuhober等用编码HbcAg和HBeAg基因的DNA疫苗免疫小鼠，均可有效诱导产生特异性抗体应答和CTL应答，且反应强度相当。Huang ZH[12]用HBcAg DNA疫苗免疫猕猴，结果产生高滴度抗HBc IgG亚类以IgG2占优势，免疫反应偏向于Th1型。

基因佐剂的应用可从更深层次上提高机体对HBV DNA疫苗的免疫应答。IL-2[13]、IL-12[14]、IL-22[15]等TH1型细胞因子的基因联合DNA疫苗免疫能影响Th1细胞的分化，以及免疫反应的类型，可更好地增强免疫效果，起到良好的佐剂作用。

5 DNA疫苗的临床研究

1999年Tacket等[16]对7名健康志愿者进行了HBsAg DNA疫苗的安全性及耐受性测试，使用PowderJectXR1装置将HBsAgDNA疫苗接种到受试者皮下，所有志愿者耐受性良好，未报导明显不良反应，其中6名产生了持久的HBsAb，1名未产生抗体者经回顾调查认为既往曾接触过HBV。本次试验发现小剂量（0.25 mg）不能诱导体液免疫，8周以后经过加强方诱导出HbsAb。由此可见HBV DNA疫苗可作为健康人乙肝的预防性疫苗。

2003年Rottinghaus等[17]使用PMED系统（particle 2 mediated epidermal delivery）对16位常规乙肝疫苗接种后无反应的健康志愿者进行HBV DNA疫苗接种（这16位志愿者接受过正规的3次亚单位疫苗接种），其中12位产生了持久的保护性抗体反应，进一步显示出HBVDNA疫苗在疫苗接种后无反应或低反应者中的优势。

2004年法国巴斯德研究所的Mancini-Bourgine等[18]应用编码preS2/S蛋白的重组质粒免疫10例慢性乙肝病毒携带者。结果发现，疫苗能够被慢性乙肝病毒携带者很好地耐受。有2例携带者的PBMC发生抗原特异性的T淋巴细胞增殖反应，并且抗HBV特异性分泌IFN-γ的T细胞数目在免疫后有较大幅度的提高。有5例携带者的血清HBV DNA水平下降，但是这种下降仅仅是暂时性的。研究者随后设计了临床Ⅰ期试验来评价表达HBsAg和preS2/S的DNA疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。10例HBeAg阳性的慢性乙肝患者接受了DNA疫苗的治疗后耐受性较好，经3次疫苗注射后，全部患者产生了特异性抗HBsAg的分泌IFN-γ型T细胞，50%患者产生了抗preS2抗原的T细胞。研究证明了治疗性DNA疫苗的安全性和免疫效率，并且说明DNA疫苗接种能在部分慢性HBV携带者体内诱导特异性T细胞反应，显示出HBV DNA疫苗作为治疗慢性乙型肝炎的有效工具的潜力。

对慢性乙肝患者而言，一个合理的治疗策略可以包括抗病毒药物对病毒复制的直接抑制作用以帮助恢复T细胞的反应性，以及疫苗强有力的外源性刺激来引发B细胞和T细胞反应。而将治疗性疫苗同其他抗病毒药联合使用较好的体现了这一策略，同时这一策略也在一些动物实验及临床试验中得到了证实。如在鸭感染鸭乙型肝炎病毒的早期阶段进行核酸类似物恩替卡韦（ETV）的治疗，可阻止DHBV的扩散并导致50%的鸭的病毒肝细胞彻底清除，Miller等[19]联合使用ETV和表达PreS/S抗原的DNA疫苗对感染的鸭进行治疗，发现感染后67天时，全部感染的鸭都清除了病毒，停药后也无复发；而对照组采用ETV和空白DNA载体治疗，结果仍有60%病例在ETV停用后感染扩散。Yang SH等[20]将4种HBV的质粒（pGX10S+pGX10S1/ S2/X+pGX10core+pGX10Po1）混合与pGX10hIL-12N222L为佐剂一起免疫，每月1次，并口服拉米夫定100 mg/d，联合治疗12例CHB患者，治疗结束随访12个月后50%HBV DNA转阴，而且耐受性良好。同时进行的ELISPOT检测表明Thl细胞反应，尤其是CD4+记忆T细胞反应至少可以维持40周。

我国食品药品监督局首个批准应用于临床研究的治疗性

DNA疫苗为双质粒乙肝DNA疫苗，它是以编码HBV抗原蛋白preS2+S的真核表达质粒pS2.S作为疫苗，人IL-2和

IFNγ融合蛋白的质粒作为佐剂，通过在体电脉冲技术肌内注射给药。在Ⅰ期试验中，30名健康志愿者都未出现不良反应，证明该疫苗有较好的安全性和耐受性[21]。Ⅱa期试验是据转氨酶水平将CHB患者分为2组：n1组为转氨酶水平比正常水平高1～2倍，只接受DNA疫苗治疗（n1=6）；n2组为转氨酶水平高于正常水平2倍以上（n2=33），随机按1∶2比例接受LAM+安慰剂（对照组）或LAM+DNA疫苗（治疗组）治疗。结果表明：n1组即低转氨酶患者组产生特异性分泌IFNγ的T淋巴细胞，DNA疫苗能够有效诱导抗HBV特异性细胞免疫应答。另一组中接受

LAM+DNA疫苗的患者在36周时可测得HBV DNA抑制率比LAM+安慰剂患者高，在第60周时差异有统计学意义（90.9% vs 54.5%，P=0.030）；且HBV基因耐药双位点变异（rtM204V/ I/S+rtL180 M）发生例数较后者少，差异有统计学意义（4.5% vs 36.4%，P=0.030）；与LAM+安慰剂对照组比较，LAM+DNA疫苗治疗组显示较低的病毒学突破率（P=0.030）和更高的HBV特异性T淋巴细胞免疫应答率[22]。为进一步证明LAM+DNA疫苗治疗组的有效性和安全性，研究者将样本例数扩大至225例进行Ⅱb临床多中心随机双盲试验，目前数据显示：同前一样，在血清HBV DNA抑制率和HBeAg转换率中治疗组优于对照组。HBV DNA抑制率在48周时差异有统计学意义（10.3% vs 3.5%，P=0.044）。在第72周时，治疗组具有较高的HBeAg转换率（54.5% vs 15.8%，P=0.040），差异有统计学意义，提示双质粒

HBV DNA疫苗可诱导较强的病毒特异性T淋巴细胞免疫应答。

韩国浦项（Pohang）科技大学开发HB100 DNA疫苗，包括了5个表达所有HBV抗原蛋白和IL212的pGX10质粒[pGX10S（2 mg）+pGX10S1/S2/X（1.5 mg）+pGX10core（1.5mg）+pGX10Pol（1 mg）+pGX10h IL212N222L（2 mg）]，研究者制定12例慢乙肝患者先接受拉米夫定治疗8周，再予HB-100疫苗治疗的方法，目的为观察疫苗和拉米夫定连用是否抗原特异免疫反应，拉米夫定停药后T细胞反应是否抑制病毒反弹，为临床I期，结果表明DNA疫苗和拉米夫定联用患者耐受性好，有50%的患者病毒滴度降低，伴随产生HBV特异性分泌

IFN2γ的T细胞，CD4+记忆性T细胞在治疗结束40周后仍检测到，但该临床试验没有设对照[23]。

比利时Innogenetics公司利用Epim2mune公司的多表位技术开发HBV多表位DNA疫苗，已经在美国完成I期临床。疫苗包含一个编码30个HBV CTL表位和16个Th表位的

DNA载体，这些表位预期能被95%的HLA人群的T细胞识别。研究目的是DNA多表位疫苗的安全性和耐受性研究，肌内注射0.4 mg或4 mg剂量疫苗，12周内每4周注射1次，共4次，在所有健康的受试者中安全且耐受性好[24]。

从上看出，目前乙肝DNA疫苗的研制主要围绕多表位、多载体，增加免疫佐剂等方面，而2015年韩国研究者做了一项新的尝试，将HB-100改进为HB-110，并将改进后的HB-110导入韩国患者，同时将HB-100导入白人患者，结果表明前者比后者表现出更弱的诱导HBV特异性T细胞应答和血清转换的能力[25]。作为亚洲患者，一般通过母婴垂直传播感染的患者，似乎比白人有更高的免疫耐受水平，所以要开发有效的治疗HBV DNA疫苗的新方法，比起增强免疫原性，打破免疫耐受可能更迫切需要。

6 结语

慢性乙型肝炎是危害人民身体健康的重大传染病，目前使用的药物仅能抑制病毒复制，不能彻底清除病毒。免疫治疗成为慢乙肝治疗的一个重要手段，而如何有效、全面地激发患者的免疫系统，重建对乙型肝炎病毒的免疫力，可能是消除慢性感染的关键。乙肝DNA疫苗，无论是编码表面抗原还是编码核心抗原，均可诱导出HBV特异性的CTL反应。

DNA疫苗的免疫保护作用已得到公认，与核苷类似物的联用在临床试验上也被证实能提高HBV-DNA阴转，HBeAg血清学转换率，在部分慢乙肝患者体内诱导特异性免疫反应，使治疗性HBV-DNA疫苗有望成为新的治疗策略。但HBV-DNA疫苗要在临床上广泛应用，还有很长的路要走。DNA疫苗还有很多环节需要深入的探讨和研究如HBV DNA疫苗疗程的选择，增强免疫原及其接种的时机的选择，与何种抗病毒药物联用、时机选择、如何实现个体化治疗等。由于DNA疫苗转染率较低，免疫反应起效慢，效果较弱，如何更好地提高HBV特异性免疫应答的强度，并延长其持续时间，均是治疗性HBV-DNA疫苗研究和开发过程中亟待解决的问题。而DNA疫苗研究时间较短，已完成的临床研究不多，而且其作用机制尚不十分清楚，但随着分子生物学和免疫学等相关科学的发展，相信在不久的将来，治疗性HBV DNA疫苗在经过不断改善提高后将为人类根治乙肝起到重要作用。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.32.006

江西 341000 赣州市人民医院感染性疾病科（刘娟）