犬孕酮几种检测方法比较

贾佳丽，王　辉，韩　飞，李　乐，郑小凡（.新乡市动物卫生监督所，河南　新乡　453000；.新乡雅仕杰医学检验所）



犬孕酮几种检测方法比较

贾佳丽1，王辉2，韩飞1，李乐1，郑小凡1
（1.新乡市动物卫生监督所，河南新乡453000；2.新乡雅仕杰医学检验所）

犬是季节性发情动物，发情周期不同于其他动物，排卵时间在发情期间变化复杂，其最佳配种时间判定较困难。常规判定方法主要有滴血推定时间判定法、阴门观察推定法、阴门腹侧检查法、试情法等。仪器检测法主要有阴道镜检测法、阴道涂片检测法、孕酮检测法、唾液检测法、测卵仪检测法和超检测法等。确定母犬排卵时间的范围最可靠的方法是测定孕酮。孕酮的测定方法主要有电化学发光法、免疫荧光法、ELISA法、放射免疫法。本文针对犬孕酮的检测方法进行综述。

孕酮俗称黄体酮，是由黄体和胎盘产生的一种甾体激素，是卵巢黄体成熟后分泌的一种天然孕激素，分子式：C21H30O2；分子量：314.47。在体内对子宫内膜形态学影响显著，在胚囊着床的子宫内膜准备和维持妊娠方面发挥着至关重要的作用。而且孕酮还是介于内分泌和免疫系统交互作用的重要因子，具有调节月经周期，诱导子宫内膜增殖、分化，促进血管生成，激活淋巴细胞分泌非炎性细胞因子，如IL-3、IL-4、IL-10，维持妊娠环境的作用。

1　电化学发光法（ECL）

电化学发光的测试方法主要利用电化学三电极体系，通过对工作电极施加一定的电压，使溶液中的电活性物质之间发生电子得失，在电极表面形成激发态并产生光辐射，利用光检测器捕获并经过计算机处理得到电化学发光信号。已报道的ECL物质包括三联吡啶（［Ru（bpy）32+］）的钌、锇和铼类络合物、鲁米诺、吖啶酯等。常用的抗体标记物有吖啶酯标记、三联吡啶钌。

电化学发光法可以有效消除样本的本地干扰和样本对位量的散射，从而获得更高的灵敏度，其检测下限可达10-18～10-19mol/L，而且其试剂有效期长，检测快速准确，安全无毒。

例如ADVIA Centaur CP孕酮测定试剂盒，在标记试剂中，病人样品的孕酮结合到吖啶酯标记的小鼠单克隆抗孕酮抗体上。在固定试剂中游离的抗体与孕酮衍生物结合在一起，并通过共价键结合到顺磁性颗粒上，通过检测磁性颗粒对孕酮进行定量。

2　放射免疫法（RIA）

RIA是由Yalow和Berson于1959年创建的一种体外放射分析技术。原理是应用放射性同位素标记待测物，形成标记抗原。以一定量的标记抗原，与各种不同量的非标记待测物和一定浓度的特异性抗待测物抗体相互作用，其反应遵照质量作用定律，标记待测物与非标记待测物竞争抗待测物抗体的结合部位，产生不同的结合率。当标记的待测物与抗待测物抗体的量保持一定时，则标记的待测物与抗待测物抗体形成的复合物的多少就反映了待检物的含量。按照结合率与非标记待测物量为函数，画出标准竞争抑制曲线。根据测得的结合率，在曲线上找出相应的待测物量，得出精确的待检标本的待测物含量。

放射免疫测定法因为操作较复杂，需时间较长，需有一定的设备，又有放射性污染，使其应用一度受到一定限制。当今放射免疫法已经变得非常简单，购买试剂盒可以短时间快速解决所有问题。使用新型的碘125标记，辐射对人体的伤害也变得微乎其微。

放射免疫测定法是综合应用放射性核素的灵敏性和免疫反应的特异性的一种超微量测定方法。具有灵敏度高、特异性强、操作简便、反应范围广等优点。目前已知可用本方法测定激素、多肽、蛋白质、维生素、药物和其他生物活性物质300余种。

例如孕酮放射免疫分析药盒，采用了第二抗体+聚己二醇沉淀放射法放射免疫分析实验，含孕酮（PROG）的样品和125I标记的孕酮衍生物与抗体反应形成抗原抗体符合物，反应加入二抗及PEG，使免疫复合物沉淀，离心，测沉淀放射性计数。通过标准曲线得到样本中孕酮的浓度。

3　酶联免疫吸附测定法（ELISA）

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（ELISA）。

ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。例如兔抗孕酮试剂盒，就是孕酮与孕酮辣根过氧化酶（-HRP）酶联试剂之间的竞争结合。在温育时，羊抗兔IgG包被的微孔与孕酮标准品、对照品、患者样品，孕酮-HRP酶联试剂和兔抗孕酮温育反应，HRP标记的孕酮结合的量与标准品、样品或定性的对照血清中内源性孕酮对特异性孕酮抗体结合部位结合的量相竞争。这样，结合到微孔上的酮-HRP的量进一步减少，因为样品中的孕酮浓度在增加，然后弃去未结合的孕酮-HRP并洗涤微孔，加入显色剂温育显色，再加入HCL终止反应并在450 nm处测量光密度值，孕酮-HRP的量与样品中孕酮的量呈反比例关系并与所形成的颜色的深浅成一定比例，通过标准品浓度对吸收值标绘出标准曲线。孕酮ELISA试剂盒样品与标准品一同操作的对照品孕酮的浓度可以从标准曲线上计算出来。

4　小结

孕酮在发情前期即将结束时开始升高，一般达到5 ng/mg时即可排卵。一般在母犬发情之后，进行阴道黏膜检查，当阴道角质化到达50%，孕酮达到4～5 ng/ml时，发情母犬进入最佳配种期，一般在孕酮达到4～5 ng/ml后的1～3 d内完成配种。对孕酮进行监测，能更好地把握配种时间。

孕酮的检测方法除了上述的3种外，还有报道用免疫荧光法测定孕酮含量，但临床测定中已经很少使用。电化学发光法、ELISA法、放射免疫法三种方法比较，试剂方面，放射免疫法和酶联免疫法都已经国内量产，化学发光法试剂及全自动化学发光免疫分析仪仪器以进口产品占主导。在测量精度上，酶标法是定性与半定量测量，化学发光法为定量测量。线性试验和灵敏度检测中，电化学发光法优于放射免疫法。对人体的的伤害，放射免疫法有一定的放射性，酶标法的底物有一定的致癌性，化学发光法比较安全。干扰因素方面，放射免疫法和酶标法干扰因素较多。电化学发光法有很强的优势，在犬的孕酮检测中可以灵活使用。一般可使用简单仪器结合常规判定方法进行判断，昂贵犬种可使用更加精密的仪器进行测定。

收稿日期：（2016-02-26）

中图分类号：S829.2

文献标识码：

文章编号：1004-5090（2016）04-0042-02