HPLC法测定左卡尼汀注射液中有关物质2（5H）-呋喃酮的含量

李 沫，于 明，李尚颖，蒋丹丹，刘美辰，孙苓苓（辽宁省药品检验检测院，沈阳 110036）

HPLC法测定左卡尼汀注射液中有关物质2（5H）-呋喃酮的含量

李 沫＊，于 明，李尚颖，蒋丹丹，刘美辰，孙苓苓#（辽宁省药品检验检测院，沈阳 110036）

目的：建立测定左卡尼汀注射液中有关物质2（5H）-呋喃酮含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为APS-2 Hypersil，流动相为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH4.7）-乙腈（35∶65，V/V），流速为1.0 ml/min，检测波长为205 nm，柱温为30Ⅱ，进样量为20 μl。结果：2（5H）-呋喃酮检测质量浓度线性范围为0.001 974～0.987 mg/ml（r＝0.999 9）；定量限为4.0 ng，检测限为1.2 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2%；加样回收率为97.04%～103.36%（RSD＝0.24%，n＝9）。结论：该方法简便、灵敏度高、重复性好，适用于左卡尼汀注射液中有关物质2（5H）-呋喃酮的含量测定。

左卡尼汀注射液；有关物质；2（5H）-呋喃酮；高效液相色谱法

左卡尼汀是哺乳动物能量代谢所必需的天然物质，其注射液临床上主要用于左卡尼汀缺乏引起的脂肪代谢紊乱[1]。经查询，全国共有10家左卡尼汀注射液生产企业，产品规格均为5 ml∶1 g；左卡尼汀注射液在《中国药典》中没有收载，现行标准共有5个，其中1个为部颁标准，4个为企业的注册标准，而现行标准中均没有对有关物质2（5H）-呋喃酮作相关要求。因此，笔者在参考《欧洲药典》8.0版[2]中左卡尼汀原料药有关物质检测方法及其他参考文献[3-5]的基础上，采用高效液相色谱法（HPLC）建立了测定左卡尼汀注射液中有关物质2（5H）-呋喃酮含量的方法，以期为控制该制剂的质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

e2695型HPLC仪，包括2489型紫外检测器和2998型二极管阵列检测器（美国Waters公司）；XP205型百万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Orion 3-Star型酸度计（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 药品与试剂

左卡尼汀注射液（国内A、B、C、D 4家企业的62批样品）；左卡尼汀对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101041-201302，纯度：99.9%）；2（5H）-呋喃酮对照品（美国Alfa Aesar公司，批号：10172668，纯度：98%）；乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：APS-2 Hypersil（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH4.7）-乙腈（35∶65，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：205 nm；柱温：30Ⅱ；进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取2（5H）-呋喃酮对照品10.11 mg，置于200 ml量瓶中，用流动相溶解并定容，摇匀，得质量浓度为0.05 mg/ml的对照品贮备液。精密量取上述贮备液5 ml，置于50 ml量瓶中，用流动相定容，摇匀，即得质量浓度为5 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取样品5 ml，置于100 ml量瓶中，用流动相定容，摇匀，即得质量浓度为10 mg/ml的供试品溶液。2.2.3 阴性对照溶液 按样品的处方比例及制备工艺制备不含左卡尼汀的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，各相邻成分峰的分离度＞1.5；理论板数以左卡尼汀峰计≥3 000。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.2（5H）-呋喃酮；2.左卡尼汀Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.2（5H）-Furanone；2.levocanitine

2.4 破坏性试验

按如下方法制备各破坏溶液：（1）光破坏溶液。取样品适量，在照度为4 500 lx的条件下照射5 h，精密量取2.5 ml，置于50 ml量瓶中，用流动相定容，摇匀，即得。（2）高温破坏溶液。取样品适量，置于烘箱中，于121Ⅱ加热30 min，精密量取2.5 ml，置于50 ml量瓶中，用流动相定容，摇匀，即得。（3）酸破坏溶液。精密量取样品2.5 ml，置于50 ml量瓶中，加2 mol/L盐酸溶液1 ml，于60Ⅱ水浴中加热15 min后放冷至室温，用2 mol/L氢氧化钠溶液调节至中性，用流动相定容，摇匀，即得。（4）碱破坏溶液。精密量取样品2.5 ml，置于50 ml量瓶中，加2 mol/L氢氧化钠溶液1 ml，于60Ⅱ水浴中加热15 min后放冷至室温，用2 mol/L盐酸溶液调节至中性，用流动相定容，摇匀，即得。（5）氧化破坏溶液。精密量取样品2.5 ml，置于50 ml量瓶中，加30%过氧化氢溶液0.5 ml，于60Ⅱ水浴中加热15 min后放冷至室温，用流动相定容，摇匀，即得。取上述溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图2。由图2可知，样品在光破坏条件下较稳定，2（5H）有关物质-呋喃酮的含量只有少量增加；经高温、酸、碱、氧化破坏后，2（5H）-呋喃酮的含量增加较为明显。根据文献[6]报道，左卡尼汀溶液在pH2～8、温度110～130Ⅱ的条件下能产生2（5H）-呋喃酮，结合破坏性试验结果亦可见，样品在碱性和高温条件下有关物质2（5H）-呋喃酮增加最明显。

2.5 线性关系考察

图2 破坏性试验高效液相色谱图A.光破坏；B.高温破坏；C.酸破坏；D.碱破坏；E.氧化破坏；F.未破坏；1.2（5H）-呋喃酮；2.左卡尼汀Fig 2 HPLC chromatograms of destructive testA.destroyed by light；B.destroyed by temperature；C.destroyed by acid；D.destroyed by alkali；E.destroyed by oxidant；F.not destroyed；1.2（5H）-Furanone；2.levocanitine

分别精密称取左卡尼汀对照品和2（5H）-呋喃酮对照品适量，用流动相溶解并稀释制成质量浓度均为2 mg/ml的混合对照品贮备液。取上述贮备液适量，用流动相稀释制成质量浓度分别均为0.002、0.01、0.05、0.2、1 mg/ml的系列混合对照品溶液。分别精密量取上述溶液各20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以2（5H）-呋喃酮质量浓度（x，mg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝130 400.843 1x+1 768.424 3（r＝0.999 9）。结果表明，2（5H）-呋喃酮检测质量浓度线性范围为0.001 974～0.987 mg/ml。

2.6 定量限与检测限考察

精密量取“2.5”项下质量浓度为2 mg/ml的混合对照品贮备液适量，等倍逐步稀释，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限为4.0 ng；当信噪比为3∶1时，得检测限为1.2 ng。

2.7 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，2（5H）-呋喃酮峰面积的RSD＝0.16%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：21405260）适量，于室温下放置0、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，2（5H）-呋喃酮峰面积的RSD＝0.73%（n＝5），表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定性良好。

2.9 重复性试验

取同一批样品（批号：21405260）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，2（5H）-呋喃酮的平均含量为0.003%，RSD＝1.94%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

精密量取已知含量的样品（批号：21405260）5 ml，置于10 ml量瓶中，用流动相定容，摇匀，作为供试品贮备液。精密量取供试品贮备液5 ml，共9份，分别置于50 ml量瓶中，分别精密加入低、中、高质量的2（5H）-呋喃酮对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.11 样品有关物质测定

取62批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算2（5H）-呋喃酮的含量，结果见表2。

表2 样品有关物质测定结果（n＝3，%）Tab 2 Results of related substance in samples（n＝3，%）

续表2Continued tab 2

3 讨论

在样品质量评价过程中，笔者曾采用国家药品标准中左卡尼汀注射液的含量测定条件[7]（C18柱、225 nm检测波长）测定其有关物质并与本试验中的色谱条件进行比较。结果，在色谱柱的选择方面，由于左卡尼汀极性较大，在C18柱上保留时间较短，色谱峰拖尾严重，与有关物质不能得到有效分离，而采用APS-2 Hypersil柱时，左卡尼汀与有关物质均能达到有效分离，因此本试验采用APS-2 Hypersil柱进行分析；在检测波长的选择方面，笔者采用二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内进行扫描，发现左卡尼汀及其主要有关物质均在紫外末端处有最大吸收，干扰测定，而在205 nm波长下进行检测各色谱峰分离度均较好，因此本试验选择205 nm作为检测波长。

本试验采用外标法与自身对照法分别计算了样品中2（5H）-呋喃酮的含量，由“2.11”项结果可知两种计算方法所得含量结果的差异较大。这是因为在本试验的色谱条件下，2（5H）-呋喃酮与左卡尼汀的响应值相差154倍，若采用自身对照法计算会放大2（5H）-呋喃酮的真实含量，因此建议在采用本检测方法时，用外标法进行含量计算。

综上所述，本方法简便、灵敏度高、重复性好，适用于左卡尼汀注射液中有关物质2（5H）-呋喃酮的含量测定。

[1] 刘孟娟，周陈西.左卡尼汀的临床应用进展[J].中国药师，2011，14（1）：127.

[2] Council of Europe Strasbourg.European Phamacopoeia：8.0 [S].2013：2 607-2 608.

[3] 李红英.左卡尼汀注射液的质量评价[J].北方药学，2014，11（12）：17.

[4] 王丽君，王静，王一奇.左卡尼汀注射液的制备及质量控制[J].药物研究，2013，30（5）：269.

[5] 闵翠娥，陆媛，江少仪，等.HPLC法测定左卡尼汀注射液含量及有关物质[J].广东药学院学报，2009，25（6）：588.

[6] 毛超旭，汪朝阳，谭越河，等.金属催化的2（5H）-呋喃酮反应研究进展[J].有机化学，2011，31（9）：1 377.

[7] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准WS1-（X-023）-2005Z[S].2005：61-221.

（编辑：刘 柳）

Determination of the Related Substance in Levocanitine Injection

LI Mo，YU Ming，LI Shangying，JIANG Dandan，LIU Meichen，SUN Lingling（Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of 2（5H）-Furanone in Levocanitine injection.METHODS：HPLC was performed on the column of APS-2 HYPERSIL with mobile phase of 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution（pH4.7）-acetonitrile（35∶65，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 205 nm，column temperature was 30Ⅱ，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range of 2（5H）-Furanone was 0.001 974-0.987 mg/ ml；the limit of quantitation was 4.0 ng，the limit of detection was 1.2 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 97.04%-103.36%（RSD＝0.24%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，sensitive and reproducible，and suitable for the content determination of 2（5H）-Furanone in Levocanitine injection.

Levocanitine injection；Related substance；2（5H）-Furanone；HPLC

R927.2

A

1001-0408（2016）36-5162-04 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.39

2016-05-26

2016-07-08）

＊主管药师，硕士。研究方向：化学药品质量标准。电话：024-31266303。E-mail：lemonbz@163.com

#通信作者：主任药师，博士。研究方向：药品标准。电话：024-31266505。E-mail：sunll@vip.163.com