蜗牛蛋白调控腭部发生发育的机制

李泓钰 黄洪章

中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院口腔颌面外科广东省口腔医学重点实验室 广州 510055

蜗牛蛋白调控腭部发生发育的机制

李泓钰 黄洪章

中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院口腔颌面外科广东省口腔医学重点实验室 广州 510055

蜗牛蛋白（Snail）参与调控腭部融合过程中腭中缝上皮（MES）细胞的上皮间质转化（EMT）、程序性细胞死亡（PCD）或存活以及细胞迁移等生物学行为，Snail基因失去了转化生长因子-β3的抑制而表达水平升高，此时Snail作为MEE/MES细胞的存活因子，导致腭中线上皮（MEE）/MES细胞持续存在并诱发腭裂。Snail基因编码具有锌指结构的Snail1、Snail2和Snail3等转录因子，其家族具有相似的结构，可以结合到E-钙黏蛋白的启动子，抑制其表达，可以在胚胎发生发育和肿瘤转移过程中诱导EMT。Snail基因可防止细胞因为存活因子的减少或PCD因子的积累而死亡，故Snail基因是MEE/MES细胞的存活因子和细胞运动的诱导因子。微小RNA（miRNA）不仅在人类癌细胞中发挥着重要的作用，而且在胚胎健康发育过程中必不可少。miRNA表达模式的变异和miRNA 在mRNA的结合位点的结构变异，可能导致颅面发育变异。本文就Snail基因结构与功能、Snail基因在侧腭突发育过程中表达、Snail基因与MEE/MES细胞的EMT、Snail基因与MEE/MES程序性细胞死、Snail基因是MEE/MES细胞的存活因子、微小RNA调控Snail在MEE/MES消失过程中的作用等研究进展作一综述。

蜗牛蛋白； 腭部发育； 先天性腭裂； 微小RNA

在哺乳动物胚胎腭部发生发育过程中，胚胎腭中线上皮（medial edge epithelial，MEE）细胞进入融合期后出现迁移、接触和黏附，发展为胚胎腭中缝上皮（medial epithelial seam，MES）细胞，MEE细胞随后完全消失，最终两侧腭突间质（embryonic palatal mesenchymal，EPM）细胞融合形成完整的腭板[1]。在上述过程中，MES细胞的消失是腭突成功融合的重要前提条件，否则MES细胞的持续存在将导致腭裂[2-3]。MES细胞存在着程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）、迁移和上皮间质转化（epithelial mesenchymal trans- formation，EMT）等不同形式，但是目前仍然缺乏权威而且排它性的试验证据来证明MES细胞的最终转归机制[2]。蜗牛蛋白（Snail）作为转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β信号转导通路的递质，在个体发生发育、器官纤维化和肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。Snail基因参与调控腭部融合过程中MES细胞的EMT、PCD或存活以及细胞迁移等生物学行为，提示其在腭部健康发育过程及MES细胞消失中发挥着重要的作用[3-5]。本文就Snail基因的结构和Snail基因调控腭部发生发育的机制等研究进展作一综述。

1 Snail基因的结构与功能

Snail基因定位于人体染色体20q12.3，全长5 882 bp，含有3个外显子，编码具有锌指结构的Snail1（Snaili）、Snail2（Slug）和Snail3（Smuc）等转录因子[6]。Snail基因家族具有相似的结构：高度保守的锌指结构的C末端DNA结合区和高度可变的N末端调节区，各成员间结构上的差异主要表现于中间P-S富集区域[7]。Snail基因作为E-钙黏蛋白的转录抑制因子，可以结合到E-钙黏蛋白的启动子，抑制其表达，从而在胚胎发育和肿瘤转移过程中诱导EMT的发生。E-钙黏蛋白的下调，可以使细胞失去上皮细胞极性，细胞外基质降解，细胞间连接丧失，使细胞变得具有迁移性，可从上皮游离下来并迁移到其他部位[7]。在胚胎发生发育阶段，Snail基因可抑制细胞周期蛋白D2的转录和增加P21Cip1/ WAF1的表达来抑制细胞周期，同时Snail基因也有使细胞具有抵抗生存因子缺失或促PCD因子诱导的细胞死亡的能力[8]。此外，Snail基因还能通过抑制细胞-细胞间紧密连接相关蛋白的表达及协调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等胚胎着床相关分子的表达，在胚胎着床发育过程中发挥重要的作用[9]。

2 Snail基因在侧腭突发育过程中表达

研究[3,10]显示，在胎龄13.5 d（embryonic day 13.5，E13.5），Snail基因在整个腭突间质都有表达，特别是腭突前份和腭突后份中间区域的MEE细胞下的间质表达最明显；E14.0时，侧腭突后部间质中的Snail基因表达明显下降；在E14.5，随着腭突开始融合，侧腭突后部间质中的Snail基因的基本消失，只有MES细胞附近的腭间质中少量表达，但此时开始融合的侧腭突MES细胞中存在着Snail基因的表达，随着融合的继续进行，MES细胞中的Snail基因表达消失；在腭突体外器官培养过程中阻止腭突的融合，Snail基因表达下降，这些说明融合并不是Snail基因下调的必要条件。鸡的腭部存在着生理性不融合，它的腭部表达的是Snail2基因，Snail2基因在腭突中的表达比较分散，在上皮和间质中均有散在分布[3,11-12]。

3 Snail基因与MEE/MES细胞的EMT

Snail基因在个体发育、器官纤维化和肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。Snail基因参与调控腭部融合过程MES细胞的EMT、PCD或存活以及细胞迁移等生物学过程，提示其在腭部健康发育过程及MES细胞消失发挥着重要的作用[3-5]。诱导EMT是Snail基因家族成员在脊椎动物和哺乳动物胚胎发育过程最广为人知的功能[6-7]，在发育及肿瘤形成过程中直接抑制E-钙黏蛋白的表达，是Snail基因诱导EMT的部分原因[7]。Snail是腭部发育过程中EMT及细胞存活的关键调控基因[6-7]，其作用机制可能是Snail基因通过抑制E-钙黏蛋白的表达来激活腭突融合过程中MEE细胞的EMT进程。E-钙黏蛋白的消失导致胚胎腭MES细胞分解为许多上皮岛[4]，有助于MES细胞的降解消失[13]，从而促进双侧腭突的融合[3]。

TGF-β3可诱导腭部发育过程中MES细胞EMT和细胞迁移[4]，这可能缘于TGF-β信号转导通路激活了Snail基因表达[3,14]。TGF-β3可以通过淋巴细胞样增强因子-1首先结合磷酸化的细胞信号转导分子Smad2与Smad4，再结合到E-钙黏蛋白的启动子上，抑制细胞间E-钙黏蛋白的转录，促发腭突融合过程EMT的发生[4-5]。TGF-β3也可以通过非依赖于Smad信号转导通路使P38促丝裂原激活蛋白激酶、重组人促丝裂原激活蛋白激酶-细胞外信号调节激酶1/2、细胞外信号调节激酶1/2磷酸化，激活Snail1和Snail2基因表达，直接抑制E-钙黏蛋白的转录水平，与依赖于Smad的信号转导通路共同促发腭突融合过程中的EMT发生[4-5]。

TGF-β3可以通过扭曲基因（Twist）1与E2A （E12/E47）一起形成Twist1/E47二聚体结合到Snail1基因的启动子E3区，激活Snail1基因表达，调节E-钙黏蛋白在腭突融合过程中的表达下降[13]。Kitase等[15]发现，诺考达唑可以干扰微管聚合过程，使细胞周期停留在G2/M期，微管紊乱可以阻断TGF-β3/Smad2信号转导通路的信号转导，干扰Snail基因对MEE细胞中E-钙黏蛋白的负调节和原癌基因c-myc对它的正调节，导致MEE细胞黏附复合体积累，干扰腭突融合过程中EMT的发生。

上述研究提示，腭突融合过程需要Snail基因的转录与表达，Snail基因可能通过下调E-钙黏蛋白基因的转录与表达，使双侧腭突MEE/MES细胞发生EMT，随后MEE/MES细胞消失，腭突发生融合。

4 Snail基因与MEE/MES程序性细胞死亡

Snail基因家族成员在胚胎发育过程中也通过PCD和调节细胞运动性来保护细胞[9]。TGF-β3诱导的EMT和PCD按顺序联合作用，使MES/MEE细胞经历细胞周期阻滞、细胞迁移和PCD，从而使MES细胞完全降解并形成完整的腭部[16]。MES细胞降解可能包含了腭突EMT的转化，随后MES细胞迁移离开腭上皮中缝或者发生PCD，TGF-β3可能通过磷脂酰肌醇-3-激酶/糖原合成酶激酶-3β信号转导通路调节MEE细胞转化、迁移或PCD过程中Snail1的基因表达[13]。Murray等[11]发现在Snail2基因敲除的小鼠，50％的发生继发性腭裂，但是在Snail2-/-+Snail1+/-小鼠中，100％的小鼠出现了继发性腭裂。他们认为，Snail1和Snail2基因两者间在腭突增殖发育过程中有冗余功能，Snail1基因在MES细胞中的表达下降，导致PCD减少。

5 Snail基因是MEE/MES细胞的存活因子

Snail1基因在腭间质中高表达，在腭部融合过程中少量的MES细胞中表达[3,11]。Snail基因可防止细胞因为存活因子的减少或PCD因子的积累而死亡，所以Snail基因是MEE/MES细胞的存活因子和细胞运动的诱导因子，而非EMT的诱导因子[7]。在Tgf-β3-/-小鼠胚胎的MES细胞中，Tgf-β1失去Tgf-β3的抑制后，其补偿表达可以诱导Snail1基因的表达急剧升高，同时使PCD减少[7]。由于鸡胚腭部没有Tgf-β3的表达，因此，在鸡胚腭部也与Tgf-β3-/-小鼠胚胎腭部一样，存在Snail2基因的广泛表达，导致MEE细胞无法发生PCD[12]。Snail基因通过2种方式来维持MEE细胞的存在[3]：1）Snail1基因在野生型小鼠中通过诱导一部分MES细胞发生EMT来诱导Tgf-β3调控MES细胞的PCD效应；2）在健康鸡胚腭部的Snail2基因及Tgf-β3-/-小鼠中的Snail1基因，在MEE细胞中作为一种存活因子而非诱导因子诱导EMT的发生，从而导致MEE细胞的持续存在，进而分化为角质上皮。

6 微小RNA调控Snail基因在MEE/MES消失过程中的作用

微小RNA （microRNA，miRNA）是一类由22个核苷酸组成的小分子、内源性、非编码RNA，其功能广泛，在转录后调控基因的表达方面，不仅在人类癌症中发挥着重要的作用，而且在胚胎健康发生发育过程中同样必不可少[17-18]。研究[19]证实，miRNA表达模式的变异和miRNA在mRNA的结合位点的结构变异，可能导致颅面发育变异，影响颅面疾病的发展。继发腭等颌面组织发生发育的细胞信号级联放大通路，精密的分化过程和器官的形态形成都与miRNA的不同表达有关[20]。miRNA可以通过调控细胞增殖、黏附、分化和PCD以及EMT进而影响颌面部组织器官形成[21]。Mukhopadhyay等[21]发现，有68、72、66个miRNA分别在胎龄E12、E13、E14时与颌面发育密切相关，其中一个包含了miR20a、miR20b、miR22、miR206、miR362、miR106a、miR152和miR140表达的基因网络可能起着核心的调控作用，它们与许多生理活动，如细胞增殖、上皮细胞生长和细胞存活尤为相关。迄今有关miRNA在腭部发生发育的作用及其机制的相关研究较少，大部分研究都集中在miR200家族及miR140。

在斑马鱼中，miR-140可以靶向抑制血小板衍生生长因子受体-α介导的神经嵴细胞向口腔外胚层的迁移，该过程对于继发腭的健康形成非常重要[22]。Li等[23]证实，单核苷酸多态性可影响miR- 140的生成且与非综合征型腭裂发生有关。Li等[24]还发现，miR-17-92簇通过靶向调控TGF-β信号转导通路的信号转导参与小鼠腭胚发育。miR200家族包括miR200a、miR200b、miR200c、miR141和miR429五个成员，是维持上皮表型的重要因素，参与调控EMT以及细胞分化、程序性死亡及其干细胞性和多功能性[18,25]。E-钙黏蛋白以及Smad2和Snail基因在小鼠腭间质中表达，而miR200b同时在间质和MEE中表达，当腭突接触以后，miR-200b在融合区域周围的腭间质中不再表达[17]。miR200b在细胞水平和分子水平直接靶向作用于Smad2和Snail，抑制TGF-β介导的调节因子，同时改变腭突融合区域PCD和增殖水平；当miR200b过表达时，MES始终存在而无法消失，同时没有PCD的出现[17]。这可能是由E-钙黏蛋白持续表达所导致的，因为其表达下降能促使MES的PCD；另外一个原因可能是因为Snail基因表达下降，导致PCD数量减少[11]。

在继发腭发生发育过程中，TGF-β介导的EMT与miR 205以及mir200家族的全部5个成员的表达明显下调有关。同时，诱导miR200表达上升可阻止TGF-β诱导的EMT[26]。Shin等[17]证实，miR-200b可靶向抑制锌指E盒子结合同源蛋白（zinc finger E-box binding homeobox protein，ZEB）1和ZEB2调控EMT，参与小鼠胚胎腭的发生发育；也有研究证实，miR-200b可靶向抑制Smad2和snail，诱导E-钙黏蛋白表达，参与TGF-β信号转导通路介导的小鼠胚胎腭发生发育过程；因此，以上研究提示miR200可能通过对Snail基因的调控，参与MEE/MES消失过程中的PCD或EMT。

7 小结

Snail基因对脊椎动物和哺乳动物腭部的发生发育至关重要，Snail基因通过EMT、PCD、细胞迁移和细胞存活等多种方式，对腭部的融合、MEE/MES细胞的消失进行精密的时空调控。Snail基因在MES细胞中的短暂表达，可以诱导MES细胞发生EMT以及其后的PCD过程，促进MES细胞的消失；但是在Tgf-β3-/-小鼠腭部和鸡胚腭部中，Snail基因失去了TGF-β3的抑制而表达水平升高，此时Snail不再作为MEE/MES细胞发生EMT的诱导因子，而是成为了MEE/MES细胞的存活因子，导致这些细胞的持续存在，腭裂发生。这说明Snail 和Snail2基因介导的EMT在MEE消失和腭裂发生过程中起着关键作用，但Snail和Snail2在诱导EMT的同时亦可抗PCD。miRNA通过抑制目标mRNA的表达和稳定性，调节目标基因的表达，从而使靶基因直接或间接影响腭部的发生发育。miR200家族对于控制腭突融合区域的PCD和增殖至关重要，它与Snail之间在MES消失过程中如何精确调控PCD和EMT以及Snail基因与miR200在其中的作用目前仍不明确。有意思的是，Snail基因可抑制ΔNP63的表达，即Snail/Snail2基因可能抑制MEE上皮中ΔNP63的表达参与MEE消失[27-28]。ΔNP63、miR-200b和Snail基因调节PCD和EMT，参与MEE/ MES细胞的消失过程值得进一步探索。

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（本文采编 石冰）

Mechanisms of the transcript factor Snail during palatogenesis

Li Hongyu, Huang Hongzhang. (Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University; Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510055, China)

This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81100739).

Snail is involved in epithelial-to-mesenchymal transformation(EMT), programmed cell death(PCD), and medial epithelial seam(MES) cell migration during palatogenesis. The Snail expression becomes upregulated without inhibiting transforming growth factor（TGF）-β3 and causes cleft palate. Snail gene-encoding transcript factors, namely, Snail1, Snail2, and Snail3, can combine with the promoter of E-cadherin and inhibit its expression; these factors then induce EMT during embryogenesis and tumor metastasis. Snail is also a critical factor of MEE/MES cell survival and cell migration. MicroRNA(miRNA) are another important factor in embryogenesis. Variation in the expression pattern and mRNA binding sites of miRNA can lead to craniofacial anomalies. This review introduces the structure, functions, and expression of Snail during palatogenesis. This review also discusses the relation of Snail to EMT, PCD, and cell survival during the disappearance of MEE/MES. This review also describes the mechanisms by which miRNA regulate Snail to control the disappearance of MEE/MES.

Snail； palatogenesis； cleft palate； microRNA

Q 51

A

10.7518/gjkq.2016.04.020

2015-12-03；

2016-04-11

国家自然科学基金（81100739）

李泓钰，硕士，Email：lihongy5@163.com

黄洪章，教授，博士，Email：drhuang52@163.com