DNA甲基化在胃肠道间质瘤中的研究进展

张天闻　季　峰



·综述·

DNA甲基化在胃肠道间质瘤中的研究进展

张天闻季峰

表观遗传学改变如DNA甲基化、基因组印记、染色体灭活等，在细胞分化、胚胎发育等方面发挥着重要的作用，是肿瘤发生发展的重要机制之一。胃肠道间质瘤(GIST)作为消化系统较常见的肿瘤之一，表观遗传学改变特别是DNA甲基化也在GIST发生发展过程中发挥着重要的作用。此文回顾近年来国内外相关文献，综述相关基因甲基化在GIST发病、预后评估、治疗等方面的研究进展。

胃肠道间质瘤；表观遗传学；DNA甲基化

胃肠道间质瘤(GIST)是消化系统最常见的间叶源性肿瘤，c-kit或PDGFRA基因发生功能获得性突变是其发病的始动因素，其中前者占80%以上[1-2]。GIST的常规治疗手段是手术或内镜切除，但存在一定的局限性[3]。即使病灶完全切除，患者的5年生存率也仅为32%～78%，高危组的术后复发率高达85%～90%[4]，这可能与c-kit基因发生二次突变有关[5]。因此，需联合分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(TKI)如伊马替尼(imatinib)治疗[6-7]。有研究显示，伊马替尼可延缓75%～90%患者的疾病进展，5%患者可完全缓解[8]。近年Joensuu等[9]也肯定了放射治疗联合靶向药物在GIST治疗中的价值。但部分患者会发生继发性耐药，且野生型[10]及PDGFRA D842、D846V突变型[11]对伊马替尼并不敏感。因此亟需其他方法来克服当前的问题，鉴于表观遗传学改变如DNA甲基化在GIST发病过程中的重要作用而越来越受到重视，本文回顾相关文献就此研究进展作一综述。

1　DNA甲基化的作用机制

DNA甲基化是最常见的基因修饰方式之一，由DNA甲基转移酶(DNMT)及去甲基酶协同完成。DNA甲基化的位点常在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，在DNMT的作用下选择性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶[12]。DNMT有5种，分别为DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L，其中DNMT1可使半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化，并起到维持甲基化的作用，DNMT3A和DNMT3B则是从头开始甲基化酶。DNA异常甲基化被公认为是肿瘤发生的重要机制之一，通常发生于基因启动子的CpG岛，引起染色质结构、DNA构象和稳定性以及与蛋白质相互作用方式的改变，从而影响基因转录调控，引起基因沉默[13]。有研究显示，启动子高甲基化所导致的抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一[14]。

2　GIST中的DNA甲基化

2003年House等[15]应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对38例发生c-kit基因突变的GIST标本进行了11个抑癌基因(p16/INK4a、APC、MGMT、hMLH1、p73、E-cadherin、RAR-b、RASSF1A、RB、ER、DAPK)的甲基化程度检测，结果显示84%的样本存在异常甲基化，其中最常见的基因为MGMT(47%)、p16(45%)、RASSF1A(40%)、E-cadherin(37%)、hMLH1(34%)及APC(31%)。Okamoto等[16]对115例GIST标本进行分析后，发现4个抑癌基因(RASSF1A、P16/INK4A、E-cadherin、MGMT)存在异常甲基化，且甲基化程度随着恶性程度增加而逐渐增加，证实了DNA异常甲基化在GIST中的存在并提示相关基因甲基化水平可能与GIST恶性程度相关。

2008年Lasota等[17]发现了一种不存在c-kit基因或PDGFRA基因突变的野生型GIST，以琥珀酸脱氢酶(SDH)缺陷为主要表现[18-19]。SDH复合物位于线粒体膜内层，在电子传递链及柠檬酸循环中起作用，由SDHA、SDHB、SDHC、SDHD四个亚单位组成。SDHA是催化单位，负责将琥珀酸转变为延胡索酸，SDHB是一种铁硫蛋白，负责电子传递，SDHC及SDHD是膜锚定单位[20]。SDH缺陷可有不同的临床表现，如Carney三联征(支气管软骨瘤、多发性胃平滑肌肉瘤、肾上腺嗜铬细胞瘤)、Carney-Stratakis综合征(家族性GIST、副神经节瘤)等。该型GIST局限在胃，而肠内罕见。淋巴结转移是较特征性的表现，但只发生在少数患者中[21]。Haller等[22]发现GIST合并Carney三联征的患者的SDHC甲基化程度明显偏高，推测可能与SDHC的异常甲基化有关。目前认为该型GIST可能的发病机制包括：(1)SDH亚单位突变可能改变线粒体凋亡通路，增加氧化应激，导致DNA损伤、基因不稳定及肿瘤形成；(2)SDH缺陷导致琥珀酸积累，后者是α-酮戊二酸的类似物，可竞争性抑制α-酮戊二酸依赖的双加氧酶及TET家族，TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶，后者是DNA脱甲基化所需，从而使DNA甲基化水平和基因表达发生改变[19,23]。

DNA低甲基化可引起染色体不稳定、原癌基因激活等，可能也在GIST中起着重要作用。Igarashi等[1]发现致癌基因LINE-1在恶性GIST中的甲基化程度较良性GIST显著降低，且与肿瘤大小、转移发生率呈负相关，推测LINE-1基因低甲基化可能在诱导染色体畸变并增加GIST侵袭性方面起着重要的作用。Okamoto等[16]也持相同观点。近年来Haller等[24]用亚硫酸盐测序法对76例冰冻标本进行分析，结果显示致癌基因SPP1启动子甲基化程度与肿瘤的恶性程度呈负相关，并且应用脱甲基剂可引起剂量依赖的SPP1基因甲基化下调。SPP1是趋化因子样糖蛋白，分泌进入细胞外基质后与CD44及整合素受体结合，激活PI3K/AKT、RAS/MAPK等细胞内信号通路，通过促进增殖、转移及血管形成影响致癌潜能[25]，而PI3K/AKT、RAS/MAPK正是GIST中主要的信号通路[26]。

伊马替尼是治疗进展期GIST的有效药物，但长期用药易导致耐药性且停药后复发率较高。Yang等[27]的研究显示，长期应用伊马替尼治疗后，抑癌基因PTEN甲基化程度明显升高，而其转录产物可以抑制PI3K/Akt通路[28]，推测长期应用TKI导致PTEN基因甲基化，继而引起的PI3K/Akt/mTOR通路激活可能是GIST对TKI产生耐药的原因。

3　DNA甲基化在GIST中的应用

3.1DNA甲基化在判断疾病预后中的作用

不少文献报道DNA甲基化可作为判断GIST预后的指标。House等[15]发现抑癌基因E-cadherin发生甲基化的患者的5年生存率(19%)明显低于非甲基化者(71%)，推测该基因甲基化是提示GIST预后较差的指标之一，若伴有hMLH1基因甲基化缺失，则肿瘤易早期复发。Okamoto等[16]对115例GIST标本进行分析后发现，RASSF1A基因的甲基化程度随恶性程度增加而逐渐增加，p16基因甲基化特异性地出现在恶性GIST中，推测RASSF1A基因甲基化是肿瘤形成的早期事件且与进展相关，p16基因甲基化是进展期GIST的特殊事件，可用于疾病分期。此外，甲基化CpG岛扩增与芯片组合分析(MCAM)显示REC8、PAX3、p16等基因发生甲基化者预后显著变差。国内梁建芳等[29]也得出了类似的结论。张立东等[30]采用甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)及免疫组织化学法检测了54例GIST标本及40例正常胃肠断端组织中maspin基因甲基化和蛋白表达水平，结果显示随着GIST侵袭性的增加，maspin基因甲基化程度显著增加，其蛋白表达显著降低，推测maspin基因甲基化程度与GIST浸润进展、复发、转移密切相关，可用于评估GIST生物学行为。此外，前文提到的LINE-1、SPP1等基因甲基化程度降低与GIST侵袭性呈正相关，均可作为评估预后的指标。

3.2DNA甲基化在疾病治疗中的作用

鉴于DNA甲基化在GIST发病过程中的重要作用，不少专家提出将其作为治疗靶点，通过逆转甲基化来治疗GIST。DNMT是甲基化的关键酶，其表达及活性在多种肿瘤中被发现存在改变[31]。Subramaniam等[32]发现抑制DNMT可增加抑癌基因表达而减少肿瘤发生。Lin等[33]也认为一些可以使DNMT失活的蛋白如MDM2、AKT及CDK的抑制剂可能是治疗肿瘤的新方法。目前已有2种药物(阿扎胞苷和地西他滨)通过抑制DNMT产生脱甲基化作用而使靶基因重新表达，已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗骨髓异常增生综合征，但在GIST中的应用价值有待进一步证实[34]。

4　问题和展望

目前有关DNA甲基化仍有许多问题尚待解决，如DNA甲基化如何与其他表观遗传网络协调工作？这些网络在GIST或其他疾病中发挥了什么作用？哪些能用于预防、诊断和治疗[35]？一些结论仍有争议，如House等[15]认为E-cadherin甲基化与GIST的恶性组织学特征相关，但Saito等[36]则持相反意见。随着研究的不断深入，不同基因在GIST中的甲基化程度及其在评估危险度、预后等方面的作用也将被不断丰富和完善。相信在不久的将来会有一张完整的DNA甲基化谱，为GIST的诊断、治疗等翻开新的篇章。

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(本文编辑：林磊)

310003杭州，浙江大学医学院附属第一医院消化内科

季峰，Email: jifeng1126@sina.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.04.011

2016-01-30)