PCR技术在类风湿性关节炎中的应用及其研究进展



·综述·

PCR技术在类风湿性关节炎中的应用及其研究进展

赵海歌1，丑广程2，陈占良2，王建国2，段琳2综述，王淑仙2△审校

(1.河北大学临床医学院研究生院，河北保定 071000；2.河北大学附属医院检验科，河北保定 071000)

关键词:类风湿性关节炎；聚合酶链式反应；综述

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病，据不完全统计,我国有300万人以上患有RA，其发病率为0.3%~0.6%。RA发病原因尚不清楚，现认为其发病原因有感染因素、遗传因素和免疫因素，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现。RA诊断主要依靠临床表现、X射线检查及类风湿因子(RF)检测。随着免疫技术的不断发展，许多自身抗体广泛应用于RA的诊断，主要应用酶联免疫法检测抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKP)、抗环瓜氨酸抗体(抗CCP抗体)，以及其RF分型(IgG、IgM、IgA)。这些检查可以提供早期诊断依据，提高患者疾病的治愈率。近年来随着分子生物学技术的发展，可以直接从基因水平检测疾病，提供更可靠的特异性的临床诊断依据。

聚合酶链式反应(PCR)是体外扩增DNA的技术，它的研究已经有很长的发展历史，1985年美国科学家申请了有关PCR的第一个专利，在science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。但是最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，但是Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变形时会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，这使操作程序更加复杂化。1988年初，有研究者改用T4 DNA聚合酶进行扩增，其扩增的产物具有均一性，但是每循环一次也需要重新加入酶。1988年有研究者提取出了TaqDNA酶，此酶耐高温在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加入新酶，从而极大地提高了PCR扩增效率。在此之后，PCR方法不断被改进，很多新技术不断发展，比如具有3′→5′修复活性的热稳定DNA聚合酶代替之前不具有3′→5′修复活性的DNA聚合酶。此外，在基础原理上发展了新的技术，比如后来的反转录PCR、定量PCR及芯片PCR等新技术。本文就PCR技术在RA中的应用与发展做一简单综述。

1PCR-SSO反向杂交法和PCR-SSP法在RA中的应用

PCR-SSO即PCR序列特异性寡核苷酸扩增分析，其基本检测原理是顺序特异性寡核苷酸作为探针，用同位素或者是非放射性核素标记，然后与PCR扩增的目标产物片段杂交，根据阳性斑点判断基因型。此种方法如果在基因型较多时需要数量较多的探针对每个DNA进行多次杂交，操作繁琐，所以后来在此基础上形成了PCR-SSO反向杂交技术，即将各种不同的探针固定于同一张陌上，再将PCR产物标记，以PCR产物(待测基因DNA)反过来与探针杂交。这样一次即可完成多个等位基因分析，此种方法灵敏度高、特异度强、需要样本量少。

PCR-SSP即PCR序列特异性引物，其基本检测原理是设计出特异性引物，借助PCR获得的特异性产物，可通过电泳分析带型决定基因的型别，这极大地简化了实验操作步骤，简单易行。PCR-SSO和PCR-SSP主要用于基因分型的研究，下面介绍这两种方法在RA患者中的应用。

人类白细胞分化抗原(HLA)-DR4为RA的易感因素[1],HLA-DR4携带者在一些细小病毒等病原体感染时，可在短期内发展成RA，这较HLA-DR阴性者时间短，朱乃硕等[2]用PCR-SSO法研究发现RA患者HLA-DR4表达率要高于健康对照组。后来研究发现CD25和CD28等共刺激分子也可能与RA的发生、发展相关[3-4]。顾国浩等[5]用PCR-SSP研究发现HLA-DR4阳性的活动性RA患者的活动度明显高于HLA-DR4阴性者,表现为C反应蛋白(CRP)显著增高者高达78.6%,另外HLA-DR4阳性RA患者以IgG、IgA增高为主,而HLA-DR4阴性者则以IgM增高为主，提示HLA-DR4基因与RA发生、发展密切相关，这与朱乃硕等[2]的研究结果相似。活性T细胞,尤其是细胞毒性T细胞在RA的病理损伤中起重要作用,而共刺激分子CD28在T细胞特异性激活中是不可缺少的[6-7]，CD25是白细胞介素2受体α(IL-2Rα)分子,主要分布于活化T细胞、B细胞和巨噬细胞上,白细胞介素-2(IL-2)与之结合后发挥生物学活性。顾国浩等[5]研究发现活动性RA患者CD28+细胞百分比明显低于健康对照组，提示CD28分子在RA的免疫失调和关节炎症中起重要作用，活动性RA患者CD25+淋巴细胞明显增高,表明患者淋巴细胞处于高度活化状态[3],活动性RA患者CD25表达上升而CD28表达下降[4]。

通过以上几种指标可以看出用这两种方法可以从基因水平检测与RA相关的因素但是这两种方法各有优缺点。PCR-SSP和PCR-SSO在操作时标本需要量不多，但是需要大量的试剂，PCR-SSO在分析时检测成本高，PCR-SSP在检测时不易自动化，重复实验需要重提DNA且必须使用紫外凝胶成像仪保留原始资料极大地增加了实验成本。并且两者在HLA基因分型时不能识别非经典的HLA,所以这些基因是否与RA有关需要进一步研究。

2差异显示PCR在RA患者中的应用

高等动物在生命活动过程中，由于基因的选择性表达、各种物理化学因素导致的突变及生理因素等会导致基因表达图谱的差异。分析比较不同条件下基因表达差异能够帮助了解组织分化发育及疾病的发生机制。

差异显示PCR技术是将随机引物和锚定cDNA的引物结合使用，利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因.

基因在不同组织细胞中的表达有差异，在细胞的不同阶段和状态中的表达也有差异，研究基因表达谱的变化有助于理解细胞分化、增生、细胞周期的调节和细胞衰老凋亡的过程。差异显示PCR(DD-PCR)是一种以反转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术，可用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是筛选差异表达基因的有效方法。DD-PCR基本原理是取两种从不同组织或细胞中分离出来的细胞质RNA或mRNA做为模板，利用可能的12种不同序列的寡核苷酸作为引物oligo(dT)进行逆转录，逆转录合成的12种互补DNA(cDNA)几乎代表真核生物某一特定细胞中所有mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。DD-PCR是筛选差异表达基因比较有效的方法之一。有研究者设计的第三代DD-PCR引物中,5′端引物为8种,3′引物仍为3种,它们的组合(共24组)将覆盖所有的mRNA序列[8-9],利用DD-PCR对RA患者滑膜细胞基因进行分析。

王吉村等[10]用差示PCR技术检测RA患者滑膜细胞中高表达基因发现，RA患者滑膜细胞高表达HSP70，并且这与Schett等[11]用免疫组化研究的结果一致,他们认为,这是由于在炎性因子或切力作用下,滑膜细胞细胞内热休克蛋白因子-1的转录活性增高所致。王夏[12]用实时荧光定量PCR在研究内质网基因表达时发现非结构蛋白(UPR) 通路基因 ATF6，IRE1 表达水平与病程呈正相关。之前也有研究表明蛋白热休克蛋白(HSPs)和 ER 伴侣分子如免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)被证明能激发 B 和T 细胞免疫活性。在RA患者，滑膜组织内过度表达的 BIP 对滑膜 T 细胞有高度的选择性[13-14]。同时研究者还用差示PCR技术检测了RA患者体内的蛋白酶B基因，发现RA患者滑膜细胞高表达组织蛋白酶B的基因[10]。 这些研究结果都表明DD-PCR是筛选差异表达基因比较有效的方法之一。

3反转录PCR在RA患者中的应用

反转录PCR(RT-PCR)是一种以细胞内总RNA或者mRNA为材料进行体外扩增的技术。由于PCR中的耐热的DNA酶(Taq酶)不能以RNA或mRNA为模板，所以首先要对RNA或mRNA进行反转录生成与之互补的cDNA，然后以cDNA为模板进行扩增。RNA、DNA印迹杂交技术、原位杂交组化的进行,提取RNA需标本剂量大、细胞数多,一般外周血需50 mL分离淋巴细胞方可提取RNA,进行RNA电泳后转膜杂交。有研究者应用经典的RNA印迹杂交和RT-PCR两种技术进行实验,表明RT-PCR与RNA印迹方法完全具有可比性、相似性,认为RT-PCR是研究基因表达高效、敏感的方法,且所需RNA量极少。

林琳[15]用RT-PCR检测RA患者外周血单个核细胞(PBMC)中白细胞介素-17A(IL-17A)mRNA的表达水平发现在RA患者PBMC中IL-17AmRNA 的表达水平明显增高并与疾病活动程度呈正相关。有研究者在实验中发现RA患者关节滑液中白细胞介素-17(IL-17)水平明显高于骨性关节炎患者滑液中水平[16]。通过一系列细胞因子的作用,IL-17上调了Cyr61表达，参与慢性炎性反应[17-18],增强了RA关节的胶原破坏和重新合成、骨质的破坏及关节软骨的破坏[19]。孟明等[20]研究表明RA患者外周血中iNKT细胞频率与干扰素-γ(IFN-γ)/白细胞介素-4(IL-4)比值呈负相关。裴明等[21]用RT-PCR研究发现RA患者的滑膜中高度表达白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)。这表明细胞因子在RA患者发病中起着重要作用，可以用RT-PCR准确高效地检测出过度表达的异常相关基因，可分析mRNA是否异常及是否由其导致基因表达异常，可直接从基因水平显示与RA的相关因素。

基于RT-PCR技术的原理，Yamamoto等[22]建立了一种分析T细胞克隆型的方法,即RT-PCR/单链构象多态性分析(SSCP)。SSCP可以检测DNA序列之间的不同，进行DNA序列差异分析，在非变性条件下，单链DNA可自身折叠呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象，这种构象由单链DNA分子内的碱基顺序决定，它影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测，然后用DNA自动测序进行分析。RT-PCR/SSCP法是根据不同T细胞受体(TCR)β链V区中CDR3碱基序列的不同,来分析T细胞克隆型。其不同于常用的在体外建立抗原特异性T细胞克隆后,再分析T细胞克隆型方法的优点是,即使在特异性抗原不明的情况下,也能直接分析体内聚集的T细胞克隆型。赵文明等[23]采用RT-PCR/SSCP法,比较分析一种自发性RA小鼠模型-SKG小鼠(发病初期与后期关节内聚集的T细胞克隆型的变化,结果显示SKG小鼠自发性关节炎动物模型与TCR Vβ2和Vβ8.2的T细胞克隆型关系密切。此前有研究报道人的RA与TCR Vβ3、Vβ4、Vβ17,Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠RA模型与TCR Vβ8.2、Vβ4、Vβ17,Ⅱ型胶原蛋白诱导的小鼠RA模型与TCRVβ2、Vβ5、Vβ8 T细胞克隆型关系密切[24-25]。这些研究结果均显示某些TCR Vβ型的T细胞与RA的发展密切相关。RA的自身抗原不明确，而RT-PCR/SSCP的主要优点就是在特异性抗原不明的情况下,也能直接分析体内聚集的T细胞克隆型，所以RT-PCR/SSCP很适合用于对RA患者的T细胞克隆分型分析。

4定量PCR在RA中的检测应用

近年来定量PCR广泛用于检测RA患者中基因水平的异常。定量PCR有荧光定量PCR(FQ-PCR)又称为实时PCR,还包括水解探针(TaqMan probe)技术、杂交探针技术、分子信标技术。

FQ-PCR的基本原理是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,在PCR反应体系中加入SYBR GreenⅠ染料，该染料能选择性地掺入直双连DNA分子中，并且产生强烈的荧光，荧光信号的检测在每一个循环的延伸期完成后进行，其结合的荧光信号与DNA水平成正比。

焦志军等[26]用定量PCR检测RA患者外周血中单个核细胞Notch基因表达,结果显示RA患者外周血中存在一群高表达Notch3的活化T细胞。之后焦志军等[27]用流式细胞术和定量PCR技术，分别在蛋白质水平和mRNA表达水平检测FoxP3表达，其研究结果显示RA活动期时CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞明显减少,这群调节性T细胞可能参与了RA病理进程。曹新国等[28]用套式实时定量PCR技术检测外周血单核细胞中FOXP3+mRNA基因表达，发现CD4+CD25+T细胞数量与FOXP3+mRNA基因表达水平呈正相关。与此类似,Zappia等[29]在研究幼年型特发性关节炎(JIA)时也发现,患者外周血中CD4+CD25+数量少于健康人,而病情较轻或有自限倾向的患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞数相对较高且表达较多的FoxP3基因，这些结果表明T细胞在RA发病过程中具有重要病理作用，研究其具体作用机制对RA的病因研究和治疗具有重要作用。荀春华等[30]用实时荧光定量PCR技术检测miRNA-146a在RA患者外周血单个核细胞表达水平，并且同时用免疫法检测血清CRP、RF、IL-17、 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，分析RA患者外周血单个核细胞miRNA-146a表达水平与血清CRP、RF、IL-17、TNF- α水平的相关性，结果显示RA患者外周血单个核细胞的miRNA-146a高表达，且与血清CRP、IL-17、TNF- α水平呈明显正相关。Kong等[31]的研究发现Sirt1 可以抑制核因子 κB(NF-κB)的转录活性，从而抑制炎性细胞因子的产生，如TNF-α，白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)等，丁永利等[32]用FQ- PCR检测Ⅱ型胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)小鼠去乙酰化酶1(Sirt1)、MMP-13、基质金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)mRNA的表达，同时用ELISA 检测小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-17、IL-4和白细胞介素-10(IL-10)的水平，结果发现在CIA小鼠中Sirt1过表达，并且过表达Sirt1的小鼠中血清细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-17水平比对照组明显降低，而IL-4水平升高,这与之前的研究相似,因此Sirt1可作为新的治疗点，不过这有待于更多的研究。Lin等[33]也用FQ-PCR检测RA患者外周血中单个核细胞诱骗受体 3(DcR3)mRNA的水平发现RA患者中DcR3mRNA的表达明显高于健康者，DcR3 是一种可溶性肿瘤坏死因子受体超家族成员,可与肿瘤坏死因子配体 LIGHT、FasL 和 TLIA 竞争结合其相应的受体如 HVEM、Fas 和DcR3。不过由于DcR3 缺乏胞内区，不会传导凋亡信号[34]。DcR3主要表现为抑制细胞凋亡，调节细胞生长、分化及免疫等作用，与多种疾病的发生和发展密切相关[35],结合研究结果表明DcR3在RA发生、发展中具有重要作用，可能通过抑制凋亡途径进行，这有待于进一步研究。

FQ-PCR技术是近年来新发明的定量PCR技术，定量更准确并且具有更高的灵敏度和特异性，除此之外还有其他的优点：(1)通过显示系统实时监测PCR的扩增过程；(2)反应完成后可直接得到实验结果，无需打开反应管对产物进行电泳检测，从而避免了开盖检测环节形成的气溶胶对实验室造成的污染。

5错配PCR技术在RA患者中的应用

许多的研究表明IL-17A在RA的发病中具有重要作用，IL-17上调了Cyr61的表达，参与慢性炎性反应[15-18]。田辉等[36]通过错配 PCR 技术提高人源化抗hIL17A 单链抗体(scFv)的亲和力，为进一步开发治疗RA的人源化抗体药物奠定基础。错配PCR 技术是抗体体外亲和力提高的一种可行性方法，在保证与抗原结合能力的基础上提高了其亲和力和中和活性。

细菌感染引起RA的原因一直备受关注，近年来检测RA患者体内细菌内毒素的研究也越来越多，有研究发现RA患者体内存在葡萄球菌肠毒素e的基因，检出率为13.25%[37]。

上述是PCR技术在RA中的应用，随着PCR技术的不断发展，精密度、特异度、灵敏度不断提高，尤其是近年来广泛应用的实时荧光定量PCR技术，可对异常表达基因实时定量检测。通过PCR对RA患者基因表达的分析可以为RA的诊断和治疗提供更可靠的依据，减轻RA患者的痛苦，达到早期诊断早期治疗的目的。但是，上述研究只是针对RA患者基因方面的检测，至于其具体临床应用及其针对异常基因的药物的研制还应继续研究，并且其疗效的好坏需要更多的临床试验证明。PCR技术不断发展，每种技术具有各自的优缺点，在具体应用时应结合实际应用条件和目的选择合适的方法。通过更多的研究进一步探讨RA的发病机制和早期诊断方法，为RA的诊断、治疗、预后提供更多、更可靠的依据。

参考文献

[1]朱乃硕,王亚新,王福庆,等.中国人群HLA-DR4等位基因结构及其与类风湿关节炎相关性研究[J].中华医学杂志,1994,74(7):428-430.

[2]朱乃硕，林性玉，王亚新，等．中国人群MHC-Ⅱ类抗原DR4基因体外扩增定型分析及其与类风湿关节炎相关性的研究[J]．中国免疫学杂志，1992，8(3)：155-160．

[3]Romagnani S.Human TH1 and TH2 subsets:doubt no more[J].J Immunol,1991,12(8):256-257.

[4]张红，高敏，马东来，等．活动性类风湿关节炎患者免疫检测分析[J]．中国实验临床免疫学杂志，1997，21(6)：361-362．

[5] 顾国浩,洪宏,彭群新,等.HLA-DR4、CD25和CD28在类风湿性关节炎致病中的作用[J].临床检验杂志,2003,21(6):361-362.

[6]李玉杰．共刺激分子CD28:CTLA4/B7及CD40/CD40L和SLE[J]．国外医学:免疫学分册，2003，26(3)：116-120．

[7]Dutmer EF,Bakker WD,Verhoeven A,et al.Rheumatoid factor measured by fluorimmunoassay:a responsive measure of rheumatoid arthritis disease activity that is associated with joint damage[J].Ann Rheum Dis,2002,61(7):603-607.

[8]Liang P,Pardee AB.Differential display.A general protoco[J].Mol Biotechnol,1998,10(3):261-267.

[9]龙华，范清宇.改良差示PCR技术分离人成骨肉瘤转移基因片段[J].第四军医大学学报,1999,20(12):1038-1041.

[10]王吉村，药立波，吕厚山，等．用差示PCR法筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中的高表达基因[J]．第四军医大学学报，2001，22(4)：289-292．

[11]Schett G,Redlich K,Xu Q，et al.Enhanced expression of heat shock protein 70 (hsp70) and heat shock factor 1 (HSF1) activation in rheumatoid arthritis synovial tissue.Differential regulation of hsp70 expression and hsf1 activation in synovial fibroblasts by proinflammatory cytokines,shear stress,and antiinflammatory drugs[J].J Clin Invest,1998,102(2):302-311.

[12]王夏．内质网应激相关基因在自身免疫性疾病中的表达[D]．合肥：安徽医科大学，2012．

[13]Shoda H,Fujio K,Shibuya M,et al.Detection of autoantibodies to citrullinated BiP in rheumatoid arthritis patients and pro-inflammatory role of citrullinated BiP in collagen-induced arthritis[J].Arthritis Res Ther,2011,13(6):191.

[14]Kaser A,Lee AH,Franke A,et al.XBP1 links ER stress to intestinal inflammation and confers genetic risk for human inflammatory bowel disease[J].Cell,2008,134(5):743-756.

[15]林琳．类风湿关节炎患者TH17细胞及其相关细胞因子的表达及临床意义[D]．大连：大连医科大学，2011．

[16]Rho J,Takami M,Choi Y.Osteoimmunology:interactions of the immune and skeletal systems[J].Mol Cells,2004,17(1):1-9.

[17]Kular L,Pakradouni J,Kitabgi P,et al.The CCN family:a new class of inflammation modulators[J].Biochimie,2011,93(1):377-388.

[18]李会丹，孙悦，火蓉芬，等．组蛋白去乙酰化酶1通过NF-κB调控炎症性滑膜细胞表达Cyr61[J]．现代免疫学，2014，34(1)：1-6．

[19]Van Bezooijen RL,Van Der Wee-Pals L,Papapoulos SE,et al.Interleukin 17 synergises with tumour necrosis factor alpha to induce cartilage destruction in vitro[J].Ann Rheum Dis,2002,61(10):870-876.

[20]孟明，陈丹，许鸣华，等．类风湿关节炎患者 iNKT 细胞频率与 IFN-γ/IL-4的相关性研究[J]．中华微生物学和免疫学杂志，2015，35(3)：213-218．

[21]裴明，于长隆，曲绵域．骨关节炎和类风湿性关节炎滑膜中IL-1受体拮抗剂三种同工型的表达及其生物学意义[J]．中国运动医学杂志，2000，19(4)：368．

[22]Yamamoto K,Sakoda H,Nakajima T,et al.Accumulation of multiple T cell clonotypes in the synovial lesions of patients with rheumatoid arthritis revealed by a novel clonality analysis[J].Int Immunol,1992,4(11):1219-1223.

[23]赵文明，山本一彦．类风湿关节炎小鼠关节聚集的T细胞克隆型变化的分析[J]．细胞与分子免疫学杂志，2004，20(1)：70-72．

[24]Ye XJ,Aelion J,Endres RO,et al.Evidence for preferential T cell receptor Vβ gene usage and T cell clonal expansion in the synovium of BB rats with early-onset collagen-induced arthritis[J].Cell Immunol,1998,183(2):81-89.

[25]Bridges SL,Moreland LW.T-cell receptor peptide vaccination in the treatment of rheumatoid arthritis[J].Rheum Dis Clin North Am,1998,24(3):641-650.

[26]焦志军，王文红，陈蕾，等．定量PCR检测类风湿关节炎患者外周血单个核细胞Notch基因表达[J]．江苏大学学报:医学版，2007，17(6)：534-536．

[27]焦志军，尤海燕，陈蕾，等．类风湿性关节炎患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞检测及意义[J]．中国免疫学杂志，2007，23(10)：936-938．

[28]曹新国，王礼文．套式实时荧光定量PCR检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA[J]．临床检验杂志，2006，24(4)：289-291．

[29]Zappia E,Casazza S,Pedemonte E,et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy[J].Blood,2005,106(5):1755-1761.

[30]荀春华，胡志坚，韩峰，等．类风湿性关节炎患者microRNA-146a的表达及与血清学指标的相关性[J]．细胞与分子免疫学杂志，2013，29(5)：529-530．

[31]Kong S,Yeung P,Fang D.The class Ⅲ histone deacetylase sirtuin 1 in immune suppression and its therapeutic potential in rheumatoid arthritis[J].J Genet Genomics,2013,40(7):347-354.

[32]丁永利，陈星，蔡一强，等．过表达Sirt1调节胶原蛋白诱导的关节炎细胞因子平衡[J]．细胞与分子免疫学杂志，2014，30(10)：1034-1038．

[33]Lin WW,Hsieh SL.Decoy receptor 3:a pleiotropic immunomodulator and biomarker for inflammatory diseases,autoimmune diseases and Cancer[J].Biochem Pharmacol,2011,81(7):838-847.

[34]Xiong G,Guo H,Ge X,et al.Decoy receptor 3 expression in esophageal squamous cell carcinoma:correlation with tumour invasion and metastasis[J].Biomarkers,2011,16(2):155-160.

[35]Huang ZM,Kang JK,Chen CY,et al.Decoy receptor 3 suppresses TLR2-mediated B cell activation by targeting NF-κB[J].J Immunol,2012,188(12):5867-5876.

[36]田辉，白福良，徐黎明，等．错配PCR技术提高抗hIL17A单链抗体亲和力的研究[J]．细胞与分子免疫学杂志，2012，28(7)：722-725．

[37]Zahiri Yeganeh S,Ataee RA,Alishiri GH,et al.Bacteriological and molecular assessment of staphylococcal enterotoxin e in the blood of patients with rheumatoid arthritis[J].Jundishapur J Microbiol，2015,8(2):16621.

(收稿日期：2015-10-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.027

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0643-04

作者简介：赵海歌，女，在读研究生，主要从事免疫学与分子生物学研究。△通讯作者，E-mail:15930229171@163.com。