年龄相关性黄斑变性替代治疗中移植排斥的综述

茅希颖，袁松涛，刘庆淮



年龄相关性黄斑变性替代治疗中移植排斥的综述

茅希颖，袁松涛，刘庆淮

Review of graft rejection in age-related macular degeneration replacement therapy

Xi-Ying Mao, Song-Tao Yuan, Qing-Huai Liu

Citation:Mao XY, Yuan ST, Liu QH. Review of graft rejection in age-related macular degeneration replacement therapy.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(2):253-257

摘要

年龄相关性黄斑变性(AMD)是世界老年人群致盲的主要原因，分为非新生血管性(干性)及新生血管性(湿性)AMD两类。疾病的主要病理改变为视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能障碍及丢失。随着近年来再生医学的发展，RPE细胞替代疗法成为了AMD疾病治疗的新思路，多项临床研究中取得了显著的疗效。但是，疗效的背后仍隐藏着许多至今未能解决的问题与挑战，其中之一是与移植相关的免疫排斥。本文介绍了生理情况下以及AMD发病过程中的视网膜下腔免疫环境，重点探讨了机体对同种异体RPE的免疫应答，以及应对该免疫排斥的多种策略。

关键词：年龄相关性黄斑变性；视网膜色素上皮；移植排斥

引用：茅希颖，袁松涛，刘庆淮.年龄相关性黄斑变性替代治疗中移植排斥的综述.国际眼科杂志2016;16(2):253-257

0 引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是50岁以上人群最常见的致盲眼病[1]。随着血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的发现和深入研究，抗VEGF药物广泛应用于临床治疗湿性AMD，并取得良好的效果。对于干性AMD，尤其是晚期干性AMD所导致的地图状缺损，临床上至今没有任何有效的应对措施。

近20a间多项疗效喜人的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial, RPE)替代治疗的临床研究有望为干性AMD的治疗填补空缺。干细胞(包括胚胎干细胞、多能干细胞等)诱导分化的RPE和成熟RPE(包括胎儿、自体等)替换了病程中坏死、缺失的RPE细胞，挽救了视力的进一步丧失。其中，研究较多的替代细胞主要有人类胚胎干细胞分化的RPE(human embryonic stem cell derived RPE, hESC-RPE)和胎儿RPE(fetal RPE, fRPE)两类。hESC-RPE来源于胚囊期的内细胞团，胚胎干细胞具有分化为三个胚层中任意一种细胞类型的能力，Kawasaki等首次从胚胎干细胞中分化得到类似于RPE的细胞，这些多边形、排列紧密的色素细胞表达RPE的特异性标记物(如：ZO-1，RPE65)，顶部有微绒毛，并且具有吞噬功能[2]。多项研究证实，将其移植至AMD疾病模型小鼠(RCS小鼠)的视网膜下腔，可提高光感受器细胞的存活率[3]。

fRPE主要是从16~22wk流产胎儿的视杯中取出的，经过胰蛋白酶处理后种植在含有fRPE培养基的孔内(第0代，P0)。在繁殖过程中，当临近的细胞相互接触后，fRPE启动“再分化”程序，即表达RPE特异性蛋白和紧密连接。经过多次传代后，选取P2或P3的细胞进行移植[4]。另外，fRPE也可从胎儿视杯中取下直接用于移植[5]。移植后的fRPE在多种模型中被证实有着与RPE非常相似的细胞学和功能学特征[6]。

但是，由于以上两类替代细胞均为异体移植，因此免疫排斥反应在所难免，因此如何减轻或避免排斥反应是本综述关注的重点。本文首先介绍生理情况下的视网膜下腔免疫环境，AMD疾病状态下免疫环境的改变，探讨机体对同种异体RPE移植的免疫应答，并重点介绍应对该免疫排斥的多种策略。

1 视网膜下腔的免疫环境

1.1 生理条件下的“免疫豁免”视网膜下腔位于RPE层与视网膜外界膜之间，并一直被认为维持着免疫豁免的状态，可能机制如下[7]：(1)RPE分泌多种细胞因子(如TGF-β，PEDF等)抑制固有免疫及T细胞活化；(2)RPE细胞表面表达的Fas配体诱导免疫细胞凋亡；(3)血-视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的物理屏障作用。

但随着研究的深入，免疫豁免的概念被重新审视：免疫豁免并不是缺乏免疫反应，而是一种免疫抑制的状态。视网膜下腔重要的结构RPE可表达Toll样受体，补体成分等[8]；IFN-γ处理后可上调其MHCⅠ类和Ⅱ类的表达，使其成为潜在的抗原递呈细胞(antigen presentation cell, APC)，刺激T细胞活化。RPE可分泌多种细胞因子、趋化因子和生长因子，具有炎症刺激和抑制的双重作用。另外，视网膜小胶质细胞具有抗原递呈功能，强光照射刺激视网膜可诱导小胶质细胞招募至视网膜下腔[9]。因此，当视网膜下腔受到微生物、自身免疫、衰老等因素的影响，“免疫豁免”的环境会触发一系列强烈的免疫反应[10]。

1.2 AMD的免疫环境变化AMD致病的主要因素为氧化应激、遗传因素和衰老三种，前两个可视为损伤因素的累积，后一个可视为保护作用的降低。作用于视网膜的光损伤累积效应、补体系统基因突变所导致的补体反应增强、脂蛋白于Bruch膜上的沉积等损伤因素可贯穿于人的一生，但大部分时间内完好的BRB与免疫抑制的视网膜下腔环境阻碍了AMD的发生，维持了机体的稳态[11]。

但是随着衰老，这种平衡逐渐被打破，随后导致了恶性循环的后果。衰老可伴随着全身免疫系统的改变[12]：(1)循环内炎性因子的增加，M1型吞噬细胞向M2型(即炎性吞噬细胞)转化；(2)血管通透性增加，炎性因子和巨噬细胞渗入视网膜下腔并进一步激活T细胞和B细胞介导的获得性免疫；(3)RPE细胞和Bruch膜的老化降低了免疫抑制和保护屏障作用，加速循环炎性成分的涌入的同时，补体在玻璃膜疣上大量沉积，形成攻膜复合物 (membrane attack complex, MAC)，加剧RPE的损害。

2 同种异体RPE移植相关的免疫应答

2.1移植免疫的相关概念移植免疫同样分为固有免疫和获得性免疫。手术相关损伤或缺血所导致的感染或内源性炎性因子释放可刺激固有免疫(如补体、自然杀伤细胞和树突状细胞)的激活[1]。受体识别供体移植物触发获得性免疫，是移植免疫中最重要的组成部分。

识别“非己”通过识别细胞特异性表面蛋白，主要为MHC分子。识别MHC需要APC的参与，有直接和间接两种方式。直接识别为供体中含有APC，可直接将其表面的抗原肽-供体的MHC分子复合物(pMHC)递呈至受体T细胞；而间接识别是供体移植物的MHC抗原经受体专职APC摄取、加工、递呈至受体T细胞。因此，直接识别在移植早期急性排斥中起到重要作用。另外，APC表达的协同刺激分子作为刺激或抑制的第二信号参与T细胞的增殖分化。

接下来为效应阶段，按照免疫排斥的发生时间可分为超急性排斥(hyperacute rejection, HAR)，急性排斥(acute rejection, AR)，和慢性排斥(chronic rejection, CR)[13]。HAR主要发生于富含血管的组织，发生于移植后的数分钟到数小时；AR主要为CD4+Th1介导的迟发性超敏反应(delayed hypersensitivity, DH)，Th1分泌的IFN-γ刺激巨噬细胞等单核细胞浸润至移植部位，分泌更多的炎性因子。同时CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的细胞毒性作用与Th2介导的体液免疫也参与其中。AR发生于移植后数天或数周[14]。CR发生于移植后数月，机制仍不清，可能与T细胞的再次激活有关。

2.2同种异体RPE的抗原性和免疫原性在移植免疫中，抗原性指“异己”抗原致敏受体的能力，免疫原性指移植物受到特异性免疫反应的损伤程度[15]。将同种异体的皮肤移植至肾被膜下，移植物完全损坏，则同种异体的皮肤具有抗原性和免疫原性两种属性。探究同种异体的RPE是否也具备这两种属性，对于RPE移植的成功至关重要。

将C57BL/6小鼠的RPE层分别移植至BALB/c小鼠的肾被膜下以及视网膜下腔，两者均至少12wk未发移植物的损坏及炎症反应。从移植至肾被膜下的BALB/c小鼠脾脏中分离提取的抗原特异性T细胞注射至自体耳廓，出现耳廓肿胀的现象，此方法称为鼠耳肿胀试验(mouse ear swelling tests, Mest)，阳性即说明机体被致敏并引发了DH；而另一组Mest阴性[16]。说明移植于视网膜下腔的RPE无抗原性和免疫原性，而肾被膜下的RPE有抗原性而无免疫原性。

那么是什么导致了同种异体RPE独特的免疫特性？(1)多种器官移植的研究发现TGFβ和IL-10在抑制移植相关的DH起到重要作用[17]。体外培养的RPE上清液中预置抗TGFβ抗体，原先抑制的淋巴细胞被激活[18]。因此推测RPE自身分泌TGFβ的能力可抑制DH，维持RPE的低抗原性。(2)Wenkel将gld/gld小鼠(CD95基因敲除的C57BL/6小鼠)的单层RPE移植至BALB/c小鼠的肾被膜下，2wk后RPE层受损[16]。说明RPE表面的Fas配体介导的特异性T细胞凋亡是维持低免疫原性的重要因素。(3)随后Zamiri等[19]进行补充实验，C57BL/6小鼠的RPE细胞致敏BALB/c小鼠，随后提取出BALB/c小鼠的特异性T细胞，并注入C57BL/6小鼠与gld/gld小鼠的视网膜下腔，除注射部位的少量RPE细胞溶解外，两者RPE层均完好，未发生排斥反应。因此进一步说明，在视网膜下腔内，维持RPE的单层、紧密排列以及其紧密附着于完好的Bruch膜上的状态对于免疫原性的影响远大于RPE表面Fas配体介导的T细胞凋亡的免疫抑制作用。

另外，体外与体内实验均证实，生理条件下RPE细胞表面低表达MHCⅠ和ICAM-Ⅰ而不表达MHCⅡ。IFN-γ预处理的RPE细胞MHCⅡ和ICAM-Ⅰ的表达量提高。体外实验中无论是否IFN-γ预处理过的RPE在外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)缺失的条件下均不能激活T细胞，说明RPE的MHC与协同刺激分子的表达量不足以成功递呈抗原，需要受体APC来激活T细胞[20]。RCS鼠的视网膜切片发现大量小胶质细胞在视网膜下腔的聚集和巨噬细胞的浸润[21]，同时Ng等[15]也证实聚集密度越大，视网膜下腔内移植物排斥反应程度也越大。因此，推断RPE移植主要为间接识别途径，即与受体APC的招募至视网膜下腔有关。

综上所述，在生理条件下的视网膜下腔，同种异体的RPE移植不易发生免疫排斥；而当BRB破坏后(如AMD)，移植的RPE逐渐恢复抗原性和免疫原性，免疫排斥应运而生。

3 应对RPE移植排斥的策略

3.1移植手术各环节的优化RPE移植作为治疗AMD的创新手段在动物模型及临床试验中受到广泛研究，通常将RPE成活率和视力改善程度作为衡量手术成功的指针。近年来手术成功率不断提升，因此RPE移植具有很高的应用前景。移植手术每环节衍生出的多种方式在多年的研究中进行对比筛选。本节介绍如何优化手术的各环节以降低排斥反应的发生。

3.1.1手术对象的选择移植手术所造成的眼内损伤是增加免疫排斥风险的重要因素，通常临床表现为黄斑水肿、视网膜前膜形成和增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)。大量研究发现二次手术的黄斑水肿发病率显著提高[22]。另外，晶状体残留的患者施行玻璃体切除术黄斑水肿发病率达28%，无晶状体或前房人工晶状体的患者高达46%[1]。基于以上研究，最好选择近期未接受过眼内手术，或白内障摘除术后人工晶状体眼，可降低发生免疫排斥的风险。

另外，Algvere等[23]运用相同的植入方式以及细胞来源，对比湿性和干性AMD患者的RPE移植的免疫排斥反应，发现在未使用免疫抑制剂的情况下湿性AMD患者在移植后的3mo内均发生免疫排斥；而60%的干性AMD患者6mo后相继发生排斥，其余患者未发现排斥征象。因此，湿性AMD患者发生免疫排斥的风险大于干性AMD。

3.1.2移植细胞种类hESC-RPE与fRPE在体外体内实验分别证实了在形态与功能学与RPE相似，在近期临床试验中都取得良好结果。Schwartz等[24-25]于2012、2014年进行hESC-RPE细胞悬液移植的一期、二期临床试验，选取干性AMD患者，均未发现免疫排斥现象。但术前术后使用免疫抑制剂的缘故，掩盖了移植物本身的免疫原性。Algvere等[23, 26]选取15~17wk的fRPE经过体外培养植入干性AMD和纤维血管膜已移除的湿性AMD患者的视网膜下腔内，移植后未用免疫抑制剂，3mo内未观察到临床可见的排斥反应(如黄斑水肿、荧光素渗漏等)，但是由于MHC的不同以及缺少组织学证据，并不能排除此期有微弱免疫排斥反应的存在。

应对由于同种异体移植所带来的不可避免的MHC分子的差异，科学家首先考虑到利用患者自体视网膜边缘健康的RPE细胞进行移植，取材方便、可以避免免疫排斥，但手术过程复杂，取材局限。另外，近年来利用基因工程重新构建自体体细胞获得诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)的技术不断成熟，继而分化出的iPSC-RPE成为一类新兴的替代细胞来源[27]。为了证实理论上iPSC-RPE具有零免疫排斥的优势，Takahashi进行了一系列以猕猴为对象的实验[28]：(1)将自体iPSC-RPE移植入猕猴视网膜下腔，iPSC-RPE表面未发现MHCⅡ，仅有MHCⅠ的表达。(2)分离出猕猴的PBMCs，并与自体iPSC-RPE共培养，未发现T细胞活化的现象。(3)将自体iPSC-RPE层移植入猕猴的视网膜下腔，未使用免疫抑制剂，移植1a后未发生免疫排斥。但由于iPSC分化过程中可能出现的翻译后修饰现象，导致了iPSC-RPE微弱的抗原性，但这种免疫反应在临床上可忽略不计[29]。

3.1.3植入方法RPE有两种移植方式：RPE细胞悬液注射和单层RPE移植。细胞悬液的注射具有手术创伤小的优点，干性AMD早期患者更提倡细胞悬液的注射，最大限度降低视网膜下腔与外周循环的接触[27]。但是由于AMD患者Bruch膜的老化、细胞连接形成不足，细胞可脱离原位流入玻璃体导致PVR的形成，为了降低此类事件的发生率，Schwartz等[24]选取黄斑周边相对正常的视网膜下腔作为注射点，提高了hESC-RPE与RPE和Bruch膜的融合。但是对于湿性RPE和视网膜脱离的患者来说，单层RPE胜过细胞悬液，因为单层RPE更加接近于生理RPE的生物学效应，并迅速覆盖缺损部位，维持紧密连接的外屏障[27]。随着移植手术术式的改进和承载单层RPE支架的生物材料(具有异物反应小、有弹性和半通透性的特点)的发现，单层RPE移植的优势大大超过细胞悬液注射。单层RPE移植可增强细胞的抗氧化损伤的能力，提高存活率[30]。Diniz等[31]将hESC-RPE细胞悬液和长于聚对二甲苯(parylene)支架上的hESC-RPE单层分别移植至无胸腺的裸鼠视网膜下腔，单层hESC-RPE的存活率明显高于细胞悬液。

3.1.4免疫抑制剂的应用免疫抑制剂具有抑制固有及获得性免疫的作用，减少细胞因子介导的小胶质细胞增殖与招募，下调促炎因子的表达。围手术期使用免疫抑制剂能够降低远期的免疫排斥，提高移植细胞的存活。围手术期免疫抑制剂(霉酚酸酯和他克莫司)，联合口服或局部糖皮质激素用药，是如今临床试验的常用药[24-25]。但在如此强力的用药下，移植排斥现象仍时有发生，并且免疫抑制剂全身性的毒副作用无法忽视[1]。与运用免疫抑制剂相比，维持完整的BRB在减轻免疫排斥中处于重中之重[7]。综上，完全依赖免疫抑制剂而忽视其他环节的优化是不可取的。

3.2创新策略

3.2.1 MHC分子的靶向干预上文提到的两种抗原识别途径的中心环节均是对MHC分子的识别。胚胎滋养层细胞具有逃过母体免疫监视的能力主要是因为细胞表面缺少MHCⅡ的表达。因此，下调MHCⅡ的表达成为了抑制免疫排斥的新思路。MHCⅡ反式激活因子(CⅡTA)可招募组蛋白修饰酶至MHCⅡ启动子，启动MHCⅡ的转录[32]。因此运用siRNA和shRNA沉默CⅡTA基因可使hESC-RPE和fRPE表面不表达MHCⅡ分子，从而减少受体免疫系统对其的识别，从源头阻止免疫排斥。然而siRNA/shRNA分子运用的安全性及作用持续时间有待考量。

3.2.2间充质干细胞间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)存在于多种组织(骨髓、脂肪、肌肉、脐带)内，由于其具有分化的潜力、免疫调节和组织修复的能力[33]，成为多种退行性变和自身免疫性疾病的治疗研究方向。

多项研究表明脂肪及骨髓来源的MSC可通过导入目标基因或体外培养基内分化为类似RPE的细胞[34]。MSC-RPE可作为RPE移植的细胞来源，并且MSC细胞自体取材来源丰富，自体移植降低免疫排斥风险，但有待今后的动物及临床大量试验。

MSC已作为治疗移植物抗宿主病的治疗方法，通过其旁分泌功能可诱导T细胞分化为Treg以及阻碍树突状细胞、巨噬细胞成熟且低表达MHCⅡ和协同刺激分子，起到免疫抑制的效果。但MSC本身的激活必须依赖于这些细胞分泌的炎性因子的存在[33]。Hou等[35]将骨髓来源的MCS静脉注射至视网膜受激光损伤的小鼠体内，发现MSC聚集于视网膜下腔。根据以上两点得出，MSC仅在炎性环境下发挥免疫抑制的作用，较之传统的免疫抑制剂，具有减少对于全身系统的影响的优势。

MSC可作为急性或慢性中枢神经系统损伤的靶向治疗分子。RCS小鼠静脉或视网膜下腔注射MSC，具有阻止视网膜萎缩和功能减退的神经保护作用[36]。因此提供了继RPE移植的又一崭新的AMD治疗思路。

目前MSC应用于多种疾病的治疗并取得丰硕的成果，但对于AMD治疗的文献相当有限。因此MSC作为未来AMD替代治疗与分子治疗的新思路将充满研究前景。

4 小结

在过去的20a中，随着再生医学的蓬勃发展，RPE细胞替代疗法成为了AMD治疗的研究热点，在多种RPE替代细胞中，hESC-RPE、fRPE、iPSC-RPE等成为研究中的热门细胞，随后开展了多项临床试验，均取得了乐观的试验结果。但乐观中也并存挑战，其中之一是移植细胞能否在体内长期的存活。虽然视网膜下腔为公认的免疫豁免区域，且替代细胞在体外和体内被证实具有RPE相似的免疫学特征，但AMD的发生发展过程打破了原来“安静”的免疫环境，这为异体移植的免疫排斥反应提供了先决条件——移植物上MHC分子的表达以及循环中受体APC与移植物的接触。因此，应对免疫排斥有两大方向——寻找免疫原性小的细胞以及改善免疫微环境。然而，视网膜下腔的免疫排斥进程是缓慢的，体外的实验结果可能不适用于体内环境，因此要比较寻找出免疫排斥小的细胞替代方法最终需要大样本、长期的动物及临床试验进行佐证。

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·文献综述·

Foundation items:National Basic Research Program of China (973 Program) (No.2013CB967500, 2011CB65102)

Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Correspondence to:Qing-Huai Liu. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. liuqh0545@126.com

Received：2015-10-29Accepted：2016-01-11

Abstract•Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness among the elderly worldwide. AMD is classified as either neovascular (wet) or non-neovascular (dry). The dysfunction and loss of retinal pigment epithelial (RPE) cells is regarded as the main pathological changes of AMD. The recent development of regenerative medicine has witnessed RPE cell-replacement therapy as a new approach to treat AMD, resulting in obvious visual improvement in various studies. However, there are still many problems and challenges that remain unsolved, including graft rejection. This review introduces subretinal immune environment under both normal and AMD condition, putting emphasis on immune response to allogeneic RPE. Lastly, strategies to prevent graft rejection are discussed.

KEYWORDS:•age-related macular degeneration;retinal pigment epithelium;graft rejection

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.2.14

收稿日期：2015-10-29 修回日期： 2016-01-11

通讯作者：刘庆淮，毕业于南京医科大学,博士，主任医师，教授，研究方向：眼底病.liuqh0545@126.com

作者简介：茅希颖，南京医科大学第一临床医学院眼科在读硕士研究生。

基金项目：作者单位：(210029)中国江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院眼科