肝癌循环肿瘤细胞临床应用研究进展

龙建云，訾晓渊，李静，黄亮，曹杰，严以群(.第二军医大学附属东方肝胆外科医院肝外一科，上海00438；.第二军医大学干细胞与医学研究中心，上海00438)



肝癌循环肿瘤细胞临床应用研究进展

龙建云1，訾晓渊2，李静1，黄亮1，曹杰1，严以群1
(1.第二军医大学附属东方肝胆外科医院肝外一科，上海200438；2.第二军医大学干细胞与医学研究中心，上海200438)

[摘 要]原发性肝癌是一种恶性程度高的肿瘤，易复发及转移，其中最常见的转移途径为血行转移。循环肿瘤细胞是肝癌血行转移的中心环节，实时监测循环肿瘤细胞对患者个体化治疗、疗效评估及监测肿瘤复发转移具有很好的价值，使其成为肝癌研究的热点，但由于肝癌循环肿瘤细胞缺乏特异性的细胞表面标记物，为进一步研究及临床应用造成一定的困难。本文就肝癌循环肿瘤细胞常用的检测技术及现阶段所进行的研究结果做一综述。

[关键词]肝癌；循环肿瘤细胞；检测；临床应用

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是一种发病率在男性中排第五、女性中排第三，致死率排第三的恶性肿瘤，高发于亚、非洲，近年来发病率在欧美等地呈逐年上升趋势[1]。针对原发性肝癌，公认的治疗方案有手术切除、经导管动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、射频消融(radiofrequency ablation，RFA)、靶向药物(索拉非尼)、肝移植、放射治疗及化疗等[1-2]。但临床表明上述治疗手段均不能有效的延长患者的生存期，这主要是与肝癌易复发转移有关。肝癌的复发及转移是一个多因素、多阶段的复杂过程，其具体机制目前尚不是很明确。近年来由原发瘤灶释放入血的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)引起的复发及转移成为研究热点[3-4]。其中支持CTC最有力的证据是肝癌晚期患者行肝移植后，健康的肝脏短期内重新患上肿瘤[3]。而目前临床上主要是依靠血清及影像学检查，如血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)监测肿瘤复发，但精确性均不高，特别是对直径＜1 cm的小肝癌中[5]。因此一些学者提出与其去寻找肿瘤细胞释放入血的特异性指标，不如直接去分离及检测原发瘤灶释放入血的肿瘤细胞[6]。

1　CTC

1869年，澳大利亚学者Ashworth在尸检中首次找到类似具有肿瘤细胞特性的血细胞，由此提出CTC的概念[7]。CTC是指从原发病灶或是转移灶释放到脉管系统的肿瘤细胞，通常情况下进入循环血液中的肿瘤细胞会死亡，只有极少数生存能力强、具有高活力及高转移潜能的肿瘤细胞能生存下来，聚集形成微小癌栓，并在一定条件下形成转移灶[3]。目前主要采用了CSS(Cell Search System)检测方法捕获外周血中的CTC，CSS是一种负性富集与检测为一体的半自动检测技术，依靠上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)分选CTC，富集效率可达1×104～2×104倍，是美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)唯一批准用于检测CTC的方法，已广泛应用于乳腺癌，前列腺癌，肾癌等肿瘤研究中，具有高度灵敏性及特异性[3，8-9]。但鉴于肝癌CTC的特殊性，目前肝癌CTC研究还处于实验探索阶段。

1.1肝癌CTC与肿瘤干细胞

目前多中心研究提示肝癌CTC不单单只有一种表面标记物，CTC具有多种细胞亚群，如CD90+CD40+CTC、KRT18+EpCAMCTC、DAPI+Pan-CK+CTC、CD45-CD90+CD44+CTC、CD45-ICAM-1+CTC等，并且认为肝癌CTC具有肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)的特性[6，10-12]。Yang等[13]发现CD90+CD40+CTC具有CSC自我更新特性，Smirnov、Liu等[12，14]用流式分选法从肝癌患者外周血中分离出CD45-ICAM-1+CTC，该亚群细胞在正常人外周血液中未检测出，ICAM-1是一种受Nanog转录因子调节的细胞间黏附分子，具有诱导微小血栓及肿瘤形成的能力，Schulze 等[15]用免疫磁珠法分离EpCAM+CTC，结合临床发现EpCAM+CD45-CTC相对于EpCAM-CD45-CTC的患者具有更强致瘤性。以上研究一方面证实了肝癌CTC的存在，另一方面也表明了相对于原发部位的肿瘤细胞，CTC具有更多基因表型，具有高致瘤性、高侵袭力及高转移特性，是一种特殊类型的CSC[12，15]。因此了解CSC特性，研究CSC与CTC联系，有利于深入研究CTC基因型及表型异质性。

1.2肝癌CTC与基因

TP53是一种抑癌基因，主要控制细胞周期及细胞分化，调节生长基因的转录，在很多肿瘤患者体内处于激活状态[16]。Her-2是一种编码酪氨酸激酶受体的基因，属于上皮生长因子家族，单克隆抗体曲妥单抗即一种针对乳腺癌Her-2的靶向治疗药物[17]，但是肝癌中Her-2扩增是否具有特异性目前还存在很大的争议[18-21]。Xu等[22]根据肝细胞表面表达去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，用免疫磁珠分选出肝癌CTC，后用Hep Par1抗体进行免疫荧光鉴别，同时进行荧光原位杂交，发现2例患者17号染色体呈明显的三倍体性状，同时伴有双等位基因TP53缺失及Her-2基因扩增。但是肝癌循环肿瘤细胞中TP53缺失，Her-2基因扩增这一现象是否具有普遍性，还有待进一步的研究。Xian等[18，23]认为在恶性肿瘤中Her-2的扩增是不常见，但Neo等[19-20]认为Her-2的过表达在肿瘤中是常见的。因此需要大规模的临床研究来验证上述基因表达在肝癌CTC中是否具有特异性。

2　肝癌CTC的检测及创新

在过去的十几年里，研究人员采用了一系列技术试图去高效率捕获肝癌外周血循环肿瘤细胞，但是由于CTC数目极少，106～107个血细胞中只有不到1个CTC，使得用常规方法很难捕获[21]，至今尚未得到一个分离肝癌CTC的金方法。CTC的检测包括富集和分析两个步骤，鉴于每一种方法均存在各自的优缺点，研究人员又进行了一系列创新，将各种不同方法结合在一起，试图富集更多的CTC用来临床研究。

2.1细胞密度梯度离心和细胞过滤法

根据肿瘤细胞的物理特性筛选循环血液中的肿瘤细胞，如细胞密度梯度离心法及细胞过滤法，细胞密度梯度离心法是根据血流中不同细胞群的密度梯度差异，将肝癌病人血样品中的肿瘤细胞滤出[24]。而细胞过滤技术是指通过滤网或树脂薄膜将直径大于8 μm的肿瘤细胞分离，根据这一原理出现了各种微小过滤装置如ScreenCell装置，它可以分离出82%～88%的肿瘤细胞[25-26]。这两种方法优点在于能够保证分离到的肿瘤细胞的完整性，且不会破坏细胞表面标志物，可以为荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)、免疫磁珠分选(magnetic activated cell sortion，MACS)等做纯化前准备，并且有利于进一步的肿瘤细胞形态学及基因学分析[24]，缺点在于根据物理特性筛选CTC方法特异性及敏感性差，易混杂其他血细胞，且会遗漏掉部分肿瘤细胞[27]。

2.2流式细胞仪分选和免疫磁珠分选

流式细胞仪是根据细胞表面特异性标记物来筛选CTC，具有快速性及准确性[28]，虽然这一方法在大样本检测中有一定的局限性，但其在经过细胞梯度离心和细胞过滤后的血样品中再次分离出有EpCAM或CD133等表面标记物的肿瘤细胞中具有一定的优势[24]。免疫磁珠分选原理主要是将特殊抗体捆绑在磁珠上，抗体会与肿瘤表面的抗原发生抗原抗体反应，然后移向外部磁场从而达到分离的目的，有正性富集与负性富集两种方式，最具有代表性的是CSS或Iso ux systems[22]。但研究表明用EpCAM标记物分选肿瘤细胞的CSS分选方式并不适于肝癌。一方面尽管肝脏也是上皮源性器官，但临床肝癌组织不到30%的肿瘤细胞表达EpCAM[3]。另一方面肝癌形成转移灶过程中会发生上皮间质化(epithelial mesenchymal，EMT)，虽然肿瘤细胞能够获得侵袭性，但同时也会丧失一些特定的表面标记物表达，如EpCAM等，因此限制了以EpCAM为标记物的检验方法(CSS)的使用[29]。

2.3肝癌CTC的检测创新

鉴于单一技术分离CTC的局限性，科研人员对此进行了一系列创新，如采用新的肿瘤表面标记物如ASGPR、联合其他抗体一起检测CTC、PCR和负性富集结合、条形码粒子等检测方法。复旦肝病研究中心Li等[29]根据肝癌患者肝细胞膜表面含有大量ASGPR，且部分表达CPS1或P-CK，独创了一种联合ASGPR、CPS1、P-CK的免疫荧光染色鉴定方法，具有81%的敏感性及100%特异性。但部分研究者认为ASGPR是肝细胞表面的特异分子，80%肝癌患者肝细胞表面可以检测到，用它做标记物缺少针对肿瘤细胞的特异性[22]。因此这一模板的实用性还有待商榷。除此之外，Guo等[30]还创建了一种新模板，将负性富集和qRT-PCR结合(EpCAMmRNA+)来检测CTC，检测结果与Cellsearch系统有76.7%的相似度，具有高度敏感性及特异性，但仍需大量的样本及临床实验验证其合理性。且随着纳米技术在临床研究应用的深入，Zheng等[31]发明了一种新型的条形码粒子，带有球形胶体状结晶簇，表面有聚合放大的适体探针及六角形对称的纳米粒子，底盘有探针固定化的接触面，能够捕获多种类型的CTC，敏感性高达92.83%。但是目前这些新型的捕获CTC方法还处于摸索阶段，有待进一步完善。

3　肝癌CTC与临床表现的关系

3.1肝癌CTC与门脉癌栓的关系

既往一直认为门脉癌栓是肿瘤全身扩散的来源[32]。目前不管通过CSS直接检测还是PCR技术间接检测CTC，均提示CTC是存在于外周血液中的且其与门脉癌栓存在有着密切关系，有门静脉癌栓的患者外周血中CTC阳性率显著高于无门静脉癌栓患者[33-34]。Vona等[35]用CSS检测了44例肝癌患者外周血CTC，检出率为52%，Li等[22]用RT-PCR检测85例肝癌患者循环血液中的肿瘤细胞，通过检测CTC中MACE-1 mRNA，SSX1 mRNA，Cpf11 mRNA，发现CTC检出率与门脉癌栓的存在呈明显相关性，且CTC的数目、微小癌栓的存在会影响肿瘤扩散及患者1年生存期。门脉癌栓不仅与外周血CTC数目有关，而且脉管系统中不同部位的CTC与门脉癌栓形成也有密切的关系。Fang等[36]用CSS分别检测了42例肝癌患者外周血及右心房中CTC的存在情况，发现右心房中的中位CTC数目比外周血液中多，两个部位CTC数目存在明显差异，该差异在术前及术后均有统计学意义，且右心房中的CTC数目与肝癌门脉癌栓呈正相关。

3.2肝癌CTC与肿瘤分期的关系

为了给不同肝癌患者选择有效的个体化治疗，出现了一系列的分期方法，如Okuda分期、BCLC(Barcelona Clinic Liver Cancer)分期、CUPI(Chinese University Prognostic Index)、TNM分期、Milan分期等[37]。研究表明外周血液中的CTC阳性率及肿瘤分期(Milan、BCLC、TNM分期)呈正相关，有肉眼血管侵犯及肝外转移患者体内CTC阳性率更高。Schulze等[13]用CSS检测CTC，并根据外周血中CTC数目对肿瘤进行分期，并与临床分期进行比较，统计学提示用外周血CTC分期其准确性为61%，敏感性为58%及特异性为83%。同时Schulze等还发现了一个有趣的现象，在很多TNM分期提示为早期肝癌患者外周血中已能检测CTC，与该项研究一致的是Xu 等[22]用ASGPR及其配体联合检测的85例HCC患者，在80%早期或肿瘤＜2 cm的肝癌患者外周血已能检测出CTC。这也侧面反映了肝癌是恶性程度很高的肿瘤，早期肝癌患者即有可能发展为全身性疾病。不仅如此，我们还发现CTC阳性率及数目与肿瘤分化(Edmondson-Steiner分期)有关[38]。因此倘若能够将CTC应用于常规检查，将会有利于肝癌患者的早期期诊断，并能监测患者预后，进而延长患者的生存期。

3.3肝癌CTC与AFP的关系

AFP是临床肝癌诊断中最有意义的血清学参考指标。但研究表明AFP特异性不强，大约1/3的肝癌患者AFP呈阴性，且很多良性肝脏疾病患者体内AFP也会呈升高趋势，因此一些研究者试图去寻找血清学更为特异性的指标用来诊断AFP阴性肝癌患者[5]。而鉴于CTC的客观性，目前已成为肿瘤血清学研究热点，关于肝癌CTC与AFP之间是否存在相关性，存在很多不同的研究结果。Nel等[11]通过检测出EpCAM+CTC里特异性基因表达如IGFBP1、HGFAC、Hif1a、TGFb、KRT19，发现AFPmRNA具有75%的敏感性及71%的特异性。Schulze等[15]研究发现EpCAM+CTC的肝癌患者AFP含量均＞400 ng/mL，这与Wu等[24]研究结果一致，Wu课题组成员发现CTC阳性患者AFP通常＞300 ng/mL，且术前AFPmRNA含量与复发无明显相关性，而术后患者血液中AFPmRNA含量与复发存在风险相关，且有门脉癌栓的肝癌患者，根据AFPmRNA变化情况可以判断患者预后。Xu 等[22]用RT-PCR技术检测了85例患者外周血循环肿瘤细胞中MACE-1，SSX1，Cpf11基因mRNA，65.9%肝癌患者中发现了至少一种上述基因mRNA的表达，肝癌患者中三种CTC抗原基因mRNA的检出率与血清AFP水平无显著相关性。因此仍需要大样本的、多中心研究来明确对肝癌CTC与AFP之间的关系。

4　肝癌CTC与个体化治疗的关系

临床医生主要通过患者临床表现和影像学检查结果给患者制定不同的治疗方案，但目前肿瘤组织活检及基因检测才是个体化治疗最好的指标，然而由于穿刺活检有创，临床普及率不高。同时肿瘤转移学认为外界干预性治疗如手术，TACE术，射频，肝组织活检会导致肿瘤细胞自原发部位逸出进入脉管系统，导致外周血中肿瘤细胞增多，增加患者术后转移及复发风险[3]。肝癌恶性程度高，复发率高达60%～70%，目前主要依靠AFP及MRI发现肉眼可见的转移灶，但对于更早期的复发与转移，仍缺少有效的诊断方法，导致很多患者失去早期发现及治疗的机会。因此CTC作为一种无创有效的指标得到很大的关注，如果能够早期诊断，如果能够有效的应用于临床，监测肿瘤复发，肝癌患者的死亡将有望大大降低。

4.1肝癌CTC与手术、肝移植的关系

关于有创治疗会引起或抑制肿瘤扩散，目前仍存在很大争议。Fan等[39]通过建立肝癌原位转移模型及流式细胞仪动态监测CTC，发现术后CTC数目明显下降且远处转移发生率明显降低，因此Fan等认为手术可以控制肿瘤转移，且CTC的动态变化与肿瘤生长及远处转移灶相关。SUN等[34]开展的一项前瞻性研究发现术前及术后一个月EpCAM+CTC数目变化具有明显差异，CTC7.5 mL＞2个比＜2个的患者有更高的复发率及更短的复发周期，并且CTC7.5 mL＞2个是术后肿瘤复发的独立预测因，并且在AFP＜400 ng/mL，CTC7.5 mL＞2个的肝癌亚群患者体内，术后预防性化疗可以延缓患者肿瘤复发。总的来说，研究表明CTC可以作为监测肝癌治疗指标，但仍需要大样本研究证实CTC7.5 mL＞2是肿瘤术后复发的独立预测指标。针对CTC与肝移植的关系，鉴于纳入的肝移植患者少，尚无明确结论。但在复旦肝病研究中心小样本研究[22]中发现部分未满足Milan标准的肝移植患者外周血中CTC7.5 mL阳性率及数目甚至比一些满足Milan标准的肝移植患者还要高，并对7例行肝移植患者进行术后随访，术后一年3例CTC阴性的患者均未复发，而在其他4例CTC阳性的患者中有3例术后6个月即出现复发[22]，鉴于纳入患者数目过少无法进行统计学分析及进一步的研究[22]。

4.2肝癌CTC与TACE、放疗的关系

而针对肝癌行TACE术后会不会引起肿瘤细胞从原发灶逸出，进入脉管系统，进而导致外周血中CTC增多，说法不一[36，40]。Fang等[36]研究表明TACE术后外周血及右心房中的EpCAM+CTC无明显改变，因此认为TACE不会诱发原发部位肿瘤细胞的逃逸，进而影响患者的疾病进展时间及生存期。但在Huang等[40]研究中，却得到相反的结论，Huang等将171位患者分为TACE组及对照组，用CSS检测患者术前及术后外周血中CTC，发现两者具有显著差异；且AFP高低，肝硬化有无是患者外周血CTC数目的独立影响因素。两种结果的差异可能是由于分选肿瘤细胞方法不一致所引起的。Guo等[30]用负性富集和qRT-PCR结合的方法即EpCAMmRNA+CTC，发现大多数接受TACE术治疗的患者CTC数目下降，术前后CTC数目改变具有统计学意义；但是在接受放射治疗的患者体内该差异无统计学意义，但治疗前EpCAMmRNA+CTC数目是接受TACE及放射治疗的肝癌患者无疾病进展生存的独立预测因素，且在BCLC B和C期肝癌患者体内，治疗前EpCAMmRNA+CTC存在者相对于比EpCAMmRNA-CTC的患者疾病进展快及复发率高，这仅仅局限于单中心、小样本，仍需要大数据、多中心研究来进一步验证。此外除了单纯检测EpCAM+CTC，Nel等[11]通过检测出EpCAM+CTC里特异性基因表达如IGFBP1、AFP、HGFAC、Hif1a、TGFb、KRT19等来监测HCC患者个体化治疗疗效及预后，研究表明AFPmRNA预测疾病进展具有75%的敏感性及71%的特异性，而低表达的IGFBP1敏感性为80%、特异性为80%。由此认为EpCAM+CTC内特异性的分子表达可用于监测患者预后。

5　总结与展望

总的来是，外周血标本是临床上理想的标本来源，便于采集，创伤性小，且患者依从性强。CTC作为监测患者预后及表征的重要生物学标记，具有很好的研究意义。目前肝癌CTC研究取得了一系列进展，但现状仍不容乐观。一方面，由于缺乏特异性的CTC表面标记物，富集出的CTC数目有限；虽然各种富集分析技术研发有一定的进展，但仅局限于小样本研究，且仍存在各种不足，还需要进一步探索。另一方面，多中心小样本研究表明CTC数目及表面标记物表达有利于患者个体化治疗及监测患者预后，但是表面标记物代表的是肿瘤某一阶段特性，恶性肿瘤是一个动态变化过程，随着各种治疗的进行，肿瘤细胞会发生基因改变，丧失部分标记物的表达，进而丧失对治疗疗效的监测作用。因此建议研究人员能够动态去观察患者外周血CTC数目及表面标记物变化，找出CTC变化规律，进而指导临床治疗。随着肝癌CTC表面特异标记物的不断发现及检测手段灵敏性及特异性的提高，CTC可成为一种新兴的液体活检，无创且比血清学及影像学检查更客观性；并有望在分子生物学水平进一步阐述肿瘤发展机制，从而为肝癌患者临床分期，预后判断及个体化诊治带来新的希望。

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(本文编辑:鲁翠涛)

[通讯作者简介]严以群，主任医师，博士生导师，ehbhyyq@163.com。

作者简介][第一龙建云(1991-)，女，江西吉安人，在读硕士。

[基金项目]国家自然科学基金项目(81441063)；第二军医大学干细胞与医学研究中心研究生创新实验课题(SCMRC1406)。

[收稿日期]2015-08-02

[中图分类号]R604； R735.7

[文献标识码]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.021