布鲁菌实验室检测技术进展

龚玉姣 张 晶 周 勇 杨智聪

（广州市疾病预防控制中心，广东 广州 510440）

布鲁菌实验室检测技术进展

龚玉姣 张 晶 周 勇 杨智聪

（广州市疾病预防控制中心，广东 广州 510440）

David Bruce在19世纪60年代首次确认布鲁菌（即布氏杆菌）是人畜共患病布鲁菌病的致病菌。至今，布鲁菌病仍困扰着多个国家和地区的人和家畜，引起一系列畜牧业和公共健康方面的问题及经济损失[1]。布鲁菌病累及多个系统，临床表现不典型，其诊断具有挑战性。慢性布鲁菌病及复杂布鲁菌病如诊断不明则会产生高额的检查费用，因此检验科工作人员需要了解并掌握布鲁菌病的各项实验室诊断技术。布鲁菌病的实验室诊断主要基于从临床样本中分离出布鲁菌、标准微生物试管试验、抗布鲁菌抗体血清学检测以及布鲁菌DNA的分子检测。 本文对布鲁菌的检测方法及其最新进展综述如下。

1 布鲁菌的分离与鉴定

布鲁菌病的确诊要求从血、骨髓或其他组织和体液中分离出病原菌。临床样本中布鲁菌的菌量差别很大，因此布鲁菌的分离高度依赖于疾病的发展阶段（急性还是慢性）、抗生素的使用、临床标本是否取材得当以及培养方法是否恰当[2]。在起病前2周发热阶段获得的标本中分离出布鲁菌的几率较高；骨髓标本培养比血培养要敏感而且培养时间较短。经典的选择培养基中含有萘啶酸和杆菌肽素，严重影响马耳他布鲁菌和猪布鲁菌的生长。因此，含有万古霉素、黏菌素、制霉素、呋喃妥英和两性霉素B的新型选择培养基被推荐用于畜类标本，然而目前没有该培养基在人患布鲁菌病中使用的研究报道[3]。

患者的血经4 d左右的培养即可找到病原菌，使用自动血培养系统如BACTEC系统，检测效率会更高。但是对于疑似病例，将培养时间延长到至少4周，同时间断传代培养，才能更可靠地排除布鲁菌感染。对于含菌量较少的标本，可以采用快速培养法（shell vial culture）分离兼性厌氧的胞内菌[4]。

对可疑菌落的早期快速判断方法是玻片凝集试验，即将未经稀释的多价布鲁菌抗血清与菌落的生理盐水悬液混合并预判。布鲁菌的种类和分型鉴定则需要测试是否需要CO2、是否产生H2S、尿素酶的活性、与单特异性血清是否凝集、在选择培养基中的生长情况以及噬菌体型。以上实验耗时且判读结果因人而异，因而并不适用于临床常规检测。作为替代的半自动代谢分型系统（Micronaut）拥有93种不同的底物，既能减少手工作业时间，又能减少经实验室获得感染的几率[5]。近些年来，随着质谱技术（MALDI-TOF）的发展，质谱技术已经成为临床微生物检验的强有力工具之一。与传统方法相比，质谱技术快速、精确且经济。采用质谱的方法可以直接从培养皿或培养瓶中鉴定布鲁菌，但是细菌的鉴定需要大规模的蛋白质数据库，而由于布鲁菌传染剂量较低、一旦致病则病程较为持久，有被用于生化武器的可能性，因此布鲁菌被划分为B类“选择性生物恐怖主义物种”，这就使得针对布鲁菌数据库的建立受到极大限制[6]。

2 布鲁菌病的血清学诊断

与细菌培养不同，布鲁菌病的血清学试验快速、无害、更敏感，因此在临床工作中被广为采用。但血清学试验只能间接证明布鲁菌的感染。一般认为，凝集效价≥1:160或者在随访过程中抗体滴度升高4倍及以上则可判定为活动性布鲁菌感染。然而，患者痊愈后的数月甚至数年，抗体检测依旧可以阳性。截至目前，能够用于血清学试验的标准参考抗原还没有找到，一是因为布鲁菌的脂多糖（LPS）可与临床上其他常见细菌如耶尔森菌、志贺菌、霍乱弧菌等产生交叉反应，二是因为不是所有布鲁菌都有相同的抗原成分。

现阶段，血清凝集试验（SAT）仍然被认为是参考标准。缺点是耗时耗力。 虎红试验（RBT）将试管改良为卡片、玻片或平板，将经虎红染色的牛布鲁菌的抗原悬液与血清混合（pH=3.65），观察凝集。虎红试验快速、简单，缺点在于对于慢性布鲁菌病的假阴性较高。经典Coombs试验可以作为血清凝集试验的补充，该方法可以检测非凝集抗体。在慢性布鲁菌病以及复发布鲁菌病的患者中，SAT结果可能为阴性或不确定，此时Coombs试验诊断价值很高。不过，SAT与Coombs试验均费时费力。鉴于此，一种基于全抗体检测的免疫捕获方法布鲁菌捕获(Brucellacapt)应运而生。该方法的抗体滴度提示感染状况，与疾病的阶段无关，且抗生素治疗后抗体滴度可大幅度下降[7]。在非布鲁菌病流行地区，酶联免疫吸附试验（ELISA）也是常规检测手段之一，而且商用试剂盒可靠，结果与SAT保持高度一致[8]。尽管ELISA费用较高，但耗时短，对于慢性布鲁菌病的诊断敏感性更高。其缺点是，类风湿因子存在时易引起假阳性，IgG大量存在时检测IgM易产生假阴性。有研究进一步表明，血清膜联蛋白A2（ANXA2）的ELISA检测对于布鲁菌病椎间盘炎具有提示作用[9]。另外，用ELISA间接测定通过重组外膜结构蛋白Omp28和Omp31作为抗原刺激所产生的抗体，诊断布鲁菌病的敏感性与特异性均不亚于SAT方法[10]。最近，血清学检测与生物传感器相结合产生了一个新型快速检测方法—电化学微磁珠生物传感器法(EMBIA)。该方法将布鲁菌抗原与微磁珠结合，再与含有布鲁菌抗体的血清孵育，通过8通道电极读取电化学信号的改变并转换到电子设备上。该方法可原位检测，快速、敏感性特异性均较高[11]。

3 布鲁菌病的分子诊断

聚合酶链式反应（PCR）可用来检测培养标本和血清、全血、尿液、脑脊液、浆膜腔液体等临床样本中的布鲁菌的DNA。由于样本中菌量较少以及基质成分中含有抑制物，直接测定样本中的DNA难度极高。因此，准备样品过程中应该尽量除去抑制物，同时富集DNA模板的浓度。PCR检测的优势很多，它不依赖于疾病的阶段，敏感性远远高于血培养，比血清学检测更特异。布鲁菌DNA检测阳性可见于布鲁菌病的急性感染期、慢性感染期以及既往有过布鲁菌病感染的无症状人群。经过抗生素成功治疗的患者，在治疗期间、随访期间甚至在治愈后的数年，其布鲁菌DNA的检测均可以出现阳性结果[12]。这个现象说明布鲁菌可以在人体巨噬细胞内存活并长期存在，也说明PCR的敏感性极高。而且实时定量（real time）PCR还可用来区分急、慢性感染[13]。3.1 经典PCR 经典PCR方法诊断布鲁菌病，需要一对引物，用来扩增布鲁菌靶点基因组序列。引物可以基于表达16S核糖体RNA、外膜结构蛋白（omp2a, omp2b）、牛布鲁菌31kDa免疫原性蛋白（BCSP31）的序列，也可以是16S核糖体DNA与23S核糖体DNA之间的中间序列以及插入序列（IS711）[14]。经典PCR方法简单高效，不过该方法的效率依赖于引物的特异性。有研究专门针对BCSP31、16S核糖体RNA等设计不同的引物来探究诊断的敏感性，发现不同的引物导致诊断的敏感性差别很大[15]。实际上，临床常将采集的血样用于经典PCR方法检测布鲁菌病。其中有几方面因素会影响检测结果，如高浓度的白细胞DNA和亚铁血红素。此外，人体基因组DNA的存在也会干扰外周血PCR检测布鲁菌DNA的敏感性。有学者认为血清样本优于全血样本，但也有学者倾向于使用血块黄层及全血。此外，足够的样本量和高效的DNA提取方法也是经典PCR检测手段的关键[16]。

3.2 实时定量PCR 与经典PCR不同，实时定量PCR是在PCR过程中监测扩增而不是在PCR结束之后。与经典PCR方法相比，实时定量PCR可以计数每个血样的核酸量，同时还能实现数据的自动化。随着实时定量PCR仪器及试剂价格的下调，越来越多的患者可以通过此项技术来测量DNA拷贝数、mRNA表达水平等。最近，用实时定量PCR方法快速检测布鲁菌并进行分类的方法已被研发出来。靶标序列包括16S-23S内部转录隔离区（ITS）和omp25、omp31、BCSP 31、IS711等基因[17]。实时定量PCR更加快速、敏感、特异，重复性高。除此之外，这项检测方法容易标准化和降低实验室工作人员感染布鲁菌病的风险。有外国学者利用基于LightCycler的实时PCR技术检测血清样本中的布鲁菌DNA，发现敏感性为91.9%，而特异性高达95.4%。还有学者比较TaqMan实时PCR与传统方法检测布鲁菌病患者处于不同阶段时的血清样本，敏感性为88%，特异性为100%，阳性预测值100%，阴性预测值83%。研究人员探索多项检测方法组合对布鲁菌的诊断效力，认为即便在凝集试验是阴性的情况下，实时定量PCR、ELISA以及培养都可能提示有价值的信息[17]。通过设计一组引物，实时定量PCR还能用于分辨布鲁菌的不同品种，还可能据此检测到新的品种。当然，就像经典PCR一样，实时定量PCR的效率也取决于引物的特异性。到目前为止，针对16S-23S内部转录隔离区（ITS）以及IS711设计的引物最敏感、特异、高效。不过也有影响实时定量PCR检测方法的因素，比如从血清样本提取模板DNA时可能带有的免疫球蛋白G，会影响实时定量PCR的扩增环节[18]。

3.3 多重PCR(multiplex PCR) 多重PCR是指基于PCR技术同时扩增几段不同的DNA序列，即在同一个反应体系中进行多个独立的PCR。该技术的实现依赖于多对引物和温度调节的DNA聚合酶。引物的设计需要满足所有的引物在同一个退火温度下都能够工作。对于多重PCR而言，随着反应体系中引物的增多，引物二聚体形成的风险也相应提高。因此引物设计优化时还需考虑到非特异性PCR产物的问题。由于多重PCR能够同时扩增几段序列，一次多重PCR检测能够获得的信息是经典PCR的几倍，同时还能减少试剂的使用和缩短检测时间。目前，多重PCR可以一次性检测多种病原体。早在2003年，就有研究人员采用多重PCR的方法诊断布鲁菌病。多重PCR方法除了可以诊断布鲁菌病，还能帮助分型。在2007年，Imaoka等[19]通过设计4对引物（bcsp31、 omp2b、omp2a、omp31）在同一个反应体系中发现了布鲁菌的4种主要类型。多重PCR检测布鲁菌耗时在1.5 h左右，结果回报及时、精确，有利于追踪感染源以及快速诊断。近年来，有研究人员利用多重PCR技术来同时检测布鲁菌（IS711、bcsp31、omp2a基因）与结核分枝杆菌（IS6110、senX3-regX3、cfp31基因）。结果表明该技术切实可行，能够为肺外结核与复杂布鲁菌病的鉴别诊断提供重要依据[20]。

3.4 巢式与半巢式PCR 巢式PCR是对经典PCR技术的一种改良，其目的是减少非特异性片段的扩增。经典PCR要求引物从目标序列的两端进行扩增，然而引物有可能与其他位点结合从而扩增出非特异性目标产物。巢式PCR需要两对引物。目标DNA序列在第一对引物的参与下进行第一轮聚合酶链式反应。在引物可能随机结合到非目标序列的情况下会产生一系列扩增产物，其中只有一个产物包含了终极目标序列。在第2对引物的选择下，只有真正含有终极目标序列的首轮扩增产物才能进入第二轮扩增，从而保证了最后的扩增产物的纯度。与巢式PCR类似，半巢式PCR也有两对引物，然而第2对引物中的一个引物与第1对引物中的一个引物非常相似。因此，巢式PCR与半巢式PCR都比经典PCR特异。最近，巢式与半巢式PCR也被用来检测血样中的布鲁菌。针对IS711、IS6501、bcsp31、VirB11基因的巢式与半巢式PCR技术检测布鲁菌已有文献报道[21]。不过，巢式与半巢式PCR也有缺点，比如引物二聚体可能增多，另外，这两种方法只能检测出一组布鲁菌而无法具体分型。

3.5 两阶段PCR 两阶段PCR是经典PCR与多重PCR的结合。2013年Kamal等[22]首先针对bcsp31基因的223个碱基对序列进行扩增，该序列在各种致病型布鲁菌中高度保守；针对致病型布鲁菌的IS711序列设计不同的引物，确保每种类型布鲁菌扩增出来的DNA产物长度不一从而用于区分布鲁菌的类型；然后将第一阶段的扩增产物与多对引物进行多重PCR，此即第二阶段PCR。该方法对于疫区的布鲁菌病诊断及致病菌的分布有着很高的价值。

3.6 环介导等温扩增技术（LAMP） LAMP是一项十分精简的PCR技术，其所有扩增及检测都在等温条件下一步完成。因此该项技术对设备的要求不高，适合于发展中国家实验室使用。LAMP方法能够在等温条件下完成有赖于源自枯草芽孢杆菌的DNA聚合酶活性。当PCR反应体系中存在4种靶向特异的引物时，该酶能够催化在单一温度条件下大量扩增模板DNA序列的一个特异性片段。反应产物的量远大于同等条件下的经典PCR。如此高效的扩增使得反应产物可以采用比色法来直接检查分析[23]。有文献报道，针对bcsp31设计引物采用LAMP检测布鲁菌，其敏感性与经典PCR类似，耗时2～3 h，由于所有反应均在同一温度下完成，因此实验室配备的水浴锅即可替代经典PCR仪进而节约成本[24]。

现阶段，PCR检测布鲁菌可以作为其他临床检测的重要补充，而且还有报道指出PCR快速检测布鲁菌DNA有助于布鲁菌病处于窗口期时期（从临床起病到血清学转阳之间的时期）的诊断，窗口期时DNA阳性而凝集试验阴性的患者在3个月后复查80%的患者凝集实验转为阳性[25]。不过PCR技术成本依然较高，同时质控难以标准化，因此PCR技术仍需不断优化、服务临床。如前所述，PCR检测到的DNA可来源于急性感染期，也可来源于吞噬细胞中的布鲁菌，甚至可来源于已经死亡的细胞，因此临床上PCR结果的判读需要结合患者的临床表现以及其他实验室诊断结果。

4 总结与展望

布鲁菌病的许多方面诸如临床表现、流行病学特点、致病机制、诊断技术、治疗方式等多年以来已取得了较大进展。实验室检测技术方面，细菌的分离培养、血清学试验、DNA检测已成为三大支柱。今后亟待解决的问题是：①研发特异的血清学诊断标记物和预后标记物；②研究布鲁菌病不同疾病进程（急性、慢性、复发、治愈）的抗原表达成分从而提示疾病的进程；③研发标准化的PCR相关的分子检测流程及设计标准化的核酸探针。

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2016-04-18)

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 03. 021

广东省医学科学技术研究基金项目（B2016101）

杨智聪（E-mail:gdgzcdc@21cn.com）