组织细胞pH值测量方法研究进展

吴佩琪　梁长虹*

分子成像

组织细胞pH值测量方法研究进展

吴佩琪1，2梁长虹2*

组织细胞中的氢离子浓度是机体的一个重要体液参数，与组织细胞的功能密切相关。因此，准确测定组织细胞内外的pH值，对反映组织细胞的功能状态十分重要，对疾病的早期诊断和治疗意义重大。常用的几种可测定组织细胞pH值的方法包括MRI法、微电极法和荧光光谱法，就各种方法的原理及其优缺点进行分析，同时介绍其研究和应用进展情况，旨在为相关的实验研究提供一定的参考。

pH值测量；磁共振波谱；化学交换饱和转移技术；酰胺质子转移技术；微电极；荧光光谱

Int J Med Radiol，2016，39（4）：410-415

病理状态下，组织细胞内外常发生酸碱失衡，因此监测病变部位的pH值的大小和变化趋势可一定程度上揭示组织细胞的生理和病理情况，为疾病的早期诊断及治疗提供重要的信息［1］。正常组织细胞和病变组织细胞之间在药物吸收、释放、分布、代谢等方面都可能存在很大差异，准确、客观地揭示这种差异对设计靶向药物和个性化药物治疗方案非常有利［2］。如何进行细胞内外pH值的准确测定，尤其活体测定是研究的热点。

1　组织细胞pH值及其临床意义

氢离子浓度是指溶液中氢离子总数和总物质的量的比［3］。Sorensen于1909年提出，以氢离子浓度的常用对数的负值代替氢离子浓度来作为溶液酸碱度的简明指标，定义为氢离子浓度指数（potential of hydrogen，pH），由公式pH=-lg［H+］计算。生物体内含有大量液体称体液，pH值是一个重要的体液参数。细胞是生物体基本的结构和功能单位，机体的正常生理代谢有赖于细胞内外的酸碱平衡。研究表明，细胞内多种生命活动都受pH值的影响，例如细胞内酶活性的调节［4］、细胞生长与分化和细胞凋亡［5］等，而某些疾病（如肿瘤、肺病）的发生则可能与细胞质或者酸性细胞器（如溶酶体、内涵体等）内的pH异常有关［6］。

因此，如果可以通过某些方法记录细胞内外pH值的瞬时和/或连续变化，则可间接推测细胞的功能活动，对了解细胞处于正常功能和病理状态下的变化具有重要意义。目前临床上血气分析和尿检等方法可提供人体内环境的酸碱信息，但这些方法主要是从宏观判断机体酸碱平衡状况，而对于局部器官、组织及特殊部位（如大脑）的pH值变化，这些方法则无能为力。因此，研究可对细胞内外pH值进行准确测定的方法，尤其是可在活体情况下进行测定的方法，也就成为国内外研究者的研究热点，具有重要的临床意义。

2　MRI测定组织细胞pH值

MRI是目前唯一一种可无创地测定在体组织细胞pH值的方法，应用前景广阔。它主要包括磁共振波谱法（magnetic resonance spectroscopy，MRS）、化学交换饱和转移法 （chemical exchange saturation transfer，CEST）和酰胺质子转移法 （amide proton transfer，APT）。

2.1MRS是一种利用核磁共振现象和化学位移作用进行特定原子核及其化合物定量分析的方法［7］。

2.1.1原理位于外加磁场中的人体组织内的原子核，其共振频率不仅取决于外加磁场强度及其本身的物理性质，同时还受原子核在化合物中的化学环境的影响，同一种原子核（如H核）所在的化合物的化学环境不同则进动频率就不同，产生的磁共振频率也就不同，在频谱上产生的共振峰也就有差别，这种现象就是所谓的化学位移［8］，即相同质子在MRS中吸收信号位置不同。MRS可以利用化学位移的不同，使不同化合物可以根据其在频谱上共振峰的不同加以区别，由于共振峰的面积与共振核的数目成正比，从而能够反映化合物的浓度变化。

目前MRS法测定组织细胞pH值时，使用的探针包括31P、19F和1H探针。19F具有较好的化学位移分散，因此关于pH敏感19F化合物的研究也得到了较大的发展［9］，但由于氟化物稳定性较差且常常具有毒性，因此目前仍多用于离体实验或动物实验［10］。1H-MRS是最早应用于临床的MRS，在应用于临床方面有其独特优势，Cerdan Ballesteros首先采用咪唑乙氧羰基丙酸作为pH敏感的1H探针，这种外源性1H探针无毒、非渗透，较19F化合物安全，但该法空间分辨力较低，敏感性也有待提高［11］。19F和1H探针在测定组织细胞pH值方面的应用远不及31P探针，就31P-MRS在测定组织细胞pH值中的应用加以介绍。

31P-MRS是最早被发现可用于测定组织细胞内pH值（intracellular pH，pHi）的探针，其基本原理为：在施加外加磁场后，细胞内的无机磷库中31P的频谱发生依赖于pH值变化的化学位移，根据代谢物的MR波谱中无机磷和磷酸肌酸的位置可以计算出两者的化学位移差，参考标准曲线，即可计算出该体素的pH值［12］。

2.1.2优缺点

2.1.2.1优点①具有无创性，对细胞结构无损伤、对细胞代谢功能无影响，避免了损伤导致的pH值改变，可用于活体实验。②测量精确度较高，可精确到0.06个pH单位［13］。③可重复性好，仪器可重复用于在体组织细胞的pH值测定。④操作较为简便，设定好MR设备的序列参数即可开始测量。⑤可同时获得细胞内其他多种含磷化合物 （ATP、磷酸肌酸等）的信息，还可检测细胞内糖酵解途径的活性和细胞能态等方面的信息［7］。

2.1.2.2缺点①时间分辨力较低，实验室必须注意维持组织细胞长时间稳定的生理状态，方可测得较为准确的组织细胞pH值［14］。②空间分辨力较低，由于该法的细胞敏感性低，需要较高的细胞浓度，对单细胞pH值的测定困难；并且当细胞内pH值偏碱性时，会对测定结果的准确性产生较大影响，因此该法更适合研究细胞群体或部分器官或组织的pH值［15］。③MR设备体积庞大，须特定条件方能安装设备，不太适合普通实验室的常规使用。

2.1.3研究进展MRS不仅可以测定组织细胞pH值，还有助于理解能量代谢、代谢的调控及疾病对能量代谢的影响方式［7］。对于人体中能量代谢十分旺盛的细胞，如骨骼肌细胞等，MRS的无创、可同时检测多种代谢产物的优势极为显著。Schmid等［16］在7 T MRI上对正常人运动过程中腓肠肌细胞的pH值以及氧化磷酸化相关物质和进行了测量，得出了两者的相关关系曲线，为可能导致骨骼肌代谢受损的疾病如糖尿病和周围性血管疾病等的影像诊断提供了参考依据。MRS对组织的pH测量可为发现缺血、肿瘤病灶提供参考，Matsuo等［17］利用该法对肿瘤的放化疗疗效进行评价，并认为该法是一种理想的无创性影像方法，对肿瘤组织内pH值、pO2在治疗前后的变化等的测量结果较为精确，应用前景广阔。31P-MRS已逐渐由化学和生物学领域向动物实验、临床活体生理及病理状态下物质代谢和能量反应研究阶段迈进，已成为临床影像医学研究的重要方法。

2.2CEST法CEST成像技术是一种对pH值变化敏感的新型MRI技术，是常规磁化转移（magnetic transfer，MT）成像技术的一种，主要通过采集氢原子信号成像。

2.2.1原理人体多数组织中自由水与结合水以一定的比例存在，并不断交换，而自由水与结合水的磁化性质不同，这种转化称MT。化学交换在分子世界中普遍存在，如化学键的旋转、构象的转换和氢交换等。小分子溶液的磁化转移现象时观察到靠近水的共振频率Z谱的不对称性，并将之命名为CEST［18］。

根据所处化学环境的不同将组织中的氢质子分为3种：一是可移动的自由水中的质子（又称自由池）；二是与蛋白质等大分子结合的、受到束缚的质子（又称结合池）；三是内源性或外源性的某些游离大分子（如胺基、酰胺基等）上的质子（又称特定分子池）。这3类氢质子由于其所处化学环境的不同，导致它们虽然处于同一主磁场中，但各自拥有不同的进动频率。CEST主要研究的是特定分子池与自由池的化学交换效应。在MR设备中施加一个选择性偏置射频脉冲，选择性地饱和某个特殊共振频率的氢质子信号（即某种特定大分子），在适当的环境下（适宜温度、pH范围），这些特定分子池中的氢质子会和周围自由水中的氢质子发生化学交换，进而将部分饱和转移到自由水中的氢质子上，通过采集水信号即可体现出CEST效应的强弱。质子的化学交换速率与质子周围的环境（温度、pH值）密切相关，进行相应的运算即可得出pH值，最终获得组织pH值的高分辨空间和/或时间分布图。

2.2.2优缺点

2.2.2.1优点①无创性。可不使用外源性对比剂，避免了对比剂带来的各种不良反应，可自然地反映组织本征的生理或病理信息，从而用于活体实验。②空间分辨力良好，可提供高分辨力的组织细胞pH值空间分布信息。③敏感性及特异性非常高，多种分子探针可进行特定生理或病理组织成像，浓度可达纳摩尔级别［20］。④可获得细胞内、外的pH值，测定细胞内pH值主要依赖酰胺质子转移成像技术，而对细胞外pH值的测定则需要注入CEST成像对比剂［19］。⑤操作较为简便。设定好MR设备的序列参数即可开始测量，并且预饱和射频脉冲可以根据需要随时开关，不对其他成像序列产生影响。⑥可重复性好。仪器可重复使用，且组织细胞不受侵害。

2.2.2.2缺点①时间分辨力较低。实验室必须注意维持组织细胞长时间稳定的生理状态，方可测得较为准确的组织细胞pH值。②对单细胞pH值的测定困难。由于该法的细胞敏感性低，需要较高的细胞浓度，并且当细胞内pH值偏碱性时会对测定结果的准确性产生较大影响，因此该法更适合研究细胞群体或部分器官或组织的pH值［20］。③MR设备安装和使用受条件限制。④对比剂安全性问题。进行细胞外pH成像时须引用外源性对比剂，而后者大部分含有斓族元素［21］，其安全性尚未完全得到验证，故一般不能用于活体研究。

2.2.3研究进展作为一种较新的MRI技术，研究者们仍在不断实验，力图使该法的测量更为准确，更适于临床应用。Liu等［22］设计的新的高通量MR方法，大大减轻了磁化率所受的影响，提高了细胞内外pH值测量的准确性。不仅可进行pH成像，还可以进行代谢物（如多糖、多肽等）成像［23］。因肿瘤灶内常常有细胞缺血坏死，并且肿瘤细胞的代谢与正常细胞不同，pH值也有所不同，因此该法对肿瘤早期检出有重要意义。而这一进展主要得益于CEST对比剂的开发和应用，早期使用小分子（如糖类、氨基酸类等）合成的CEST，称反磁性CEST对比剂，后发展为使用镧族元素合成的CEST对比剂，称顺磁性CEST对比剂［24-25］。这也为脑卒中的诊断和治疗效果评价等提供了一种新的诊断技术［26］。获得pH值的绝对定量信息，尤其是获取脑部pH定量CEST图，是该技术的发展趋势，这将促使该技术更广泛地应用于临床。

2.3APT法APT成像技术是CEST成像技术的一个分支。

2.3.1原理人体内的蛋白质含有各种特殊基团，如羟基、胺基、亚胺基、酰胺基等，在CEST成像中，如果选择游离蛋白质及多肽链上的酰胺质子作为选择性偏置射频脉冲的饱和目标时，此时便可称为APT成像技术。受到射频脉冲饱和的酰胺质子与水中的氢质子不断进行化学交换，水中氢质子部分饱和，导致水成像信号下降，通过采集自由水饱和前与饱和后信号的改变，间接获得酰胺质子的交换速率，进而计算可得出pH值，最终获得组织pH值的高分辨空间（及/或时间）分布图。

2.3.2优缺点由于APT成像技术是CEST成像技术的一个分支，其优缺点与CEST法类似，故简要描述。

2.3.2.1优点①可无创性对组织的生理环境进行评估，可用于活体实验。②空间分辨力良好。③敏感性及特异性较高。④可获得高分辨力的活体蛋白质和多肽的浓度等信息，更加符合临床诊断的需要［28］。⑤操作较为简便。⑥可重复性好。⑦一般不引入外源性对比剂，无对比剂安全性的担忧。

2.3.2.2缺点①时间分辨力较低。②对单细胞pH值的测定困难。③不太适合普通实验室的常规使用。

2.3.3研究进展APT法作为一种可安全应用于人体的理想手段，并且可探测某些组织细胞内蛋白质含量的变化，其在临床上的研究和应用日益广泛。目前，该法已广泛地应用于对脑卒中的研究［29］，并且，Harston等［30］的研究认为，相较于普通的T1、T2加权影像以及DWI，APT成像对缺血半暗带的敏感性更高，可作为缺血半暗带的代谢标记图。该法也逐渐开始应用于阿尔茨海默病的研究，Wang等［31］研究发现，阿尔茨海默病病人的双侧海马区磁化转移率（在3.5ppm处，ppm表示10-6）的不对称性明显高于正常人，提示APT成像极有可能成为该病的具有生物影像标记意义的无创性影像检查方法。总之，APT成像技术是一种临床应用前景十分广阔的pH测量技术。

3　其他方法

3.1微电极法微电极是指电极尖端长为几微米至几百微米且直径在0.25～5.00 μm范围内的电极，但用于细胞外测定时，尖端直径为几百微米者也可叫作微电极。微电极法测量pH值是通过将微电极直接刺入待检测组织或细胞中进行pH值的测量。

3.1.1原理pH敏感型玻璃微电极主要由玻璃微吸管、微参比电极和pH值敏感电极（内含氢离子交换剂）组成。微参比电极与氢离子交换电极共同构成测量电池。用于细胞内、外pH值测定的微参比电极尖端直径分别为1～3 μm、50～100 μm。测定细胞内pH值时，将微电极插入待测细胞内，然后读取两电极间的电位差数值，经过相应的计算后即可得出所测pH值。

3.1.2优缺点

3.1.2.1优点①测量精确度较高，可精确到0.02～0.05个pH单位，并且校准比较简单。②时间分辨力高，既可反映pH的瞬时变化，又可持续监测细胞内pH值变化。③可同时记录细胞膜电位的改变，提供细胞功能的其他信息［32］。④微电极体积较小，较适合实验室的常规使用。

3.1.2.2缺点①具有有创性。微电极必须插入组织或细胞中才能实现对细胞外液或细胞内液中pH值的测量，必然造成组织或细胞的损伤，限制了其临床应用。②测量误差来源多，穿刺时微电极易被堵塞导致细胞液无法与pH敏感电极充分接触；穿刺损伤导致细胞液渗漏，细胞内、外液混合导致pH值改变；灰尘、油污或细胞膜物质等附着于微电极的活性表面导致pH敏感电极的敏感性降低。③重复使用率低。使用过程中氢离子交换剂不断逸失，电极功能衰退较快，因此平均工作寿命短，在一次实验过程中往往需要使用数个电极［33］。④技术操作难度大。测量细胞内pH值时必须保证微电极的活性表面仅与细胞内部液体接触，同时要避免受到细胞外液影响；操作时要借助显微镜进行观察，对操作者的操作水平也有较高的要求；受微电极尖端直径的限制，待测细胞的胞径也不能过小；由于操作复杂，所需时间较长，因此无法实现细胞内多个位点的pH值测定。

3.1.3研究进展微电极的发展主要依赖于其制作材料的发展，随着制作材料的不断改进，诸如钠、钾、钙离子敏感玻璃微电极等pH测量微电极以外的微电极也逐渐被开发出来，有的微电极同时整合了多种测量功能，大大方便了基础和临床研究，并拓展了其在生物学研究中的应用。微电极为研究钠、钾、钙等离子在细胞内外的浓度及其与pH值的相互关系、细胞内外离子跨膜转运的机制［34］等提供了有效手段。微电极的发展还衍生出了神经细胞电生理技术［35］，为研究者在神经细胞的研究提供了一大助力。目前，微电极的应用多集中于实验室，在临床方面的应用有待发展。

3.2荧光光谱法荧光光谱分析是根据物质的荧光谱线的性质及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。

3.2.1原理荧光染料一般通过扩散进入细胞，在细胞内发生水解等改变后生成荧光素分子，荧光素分子能够吸收一定波长的光子并跃迁入激发态，之后能量会以较长波长的光发散出来，荧光素分子与质子发生作用后引起荧光的变化，因此荧光的强度与随着细胞内的pH值的变化而变化。采用特定的仪器（如激光共聚焦显微镜）检测细胞内的荧光强度，再参照校准曲线，即可得出被测细胞内的pH值［36］。

3.2.2优缺点

3.2.2.1优点①测量精确度高，可精确到0.01个pH单位。②空间分辨率高，具有200 nm的空间精确度，因此能够给出细胞内pH值的二维甚至三维地图。③时间分辨率高，具有毫秒级的时间精确度，可实时监测细胞内多个位点的pH值变化［6］。④技术操作较简单，该法不受细胞浓度和大小的限制，操作相对简单，重复性较好。⑤可以测定数个细胞或大量细胞的pH值。⑥较适合实验室的常规使用。

3.2.2.2缺点①尽管此法不像微电极法那样对组织或细胞造成直接的穿刺损伤，但染料与细胞分子的螯合反应还是会改变细胞的原本结构，处理不慎还可能污染细胞；另外，部分荧光染料产生紫外区的荧光，会损伤活体样品［37］。②测量存在一定的误差，原因与染料种类、浓度和实验条件（温度和时间等）密切相关，必须根据被测组织细胞的不同及时调整前述参数；并且根据测定荧光强度的仪器的不同，须采用不同的校准曲线［38］。③不能用于细胞膜电位的测定。

3.2.3研究进展荧光光谱法的进展主要依赖于荧光染料（又称荧光探针）的开发［37］，早期羧化半萘罗丹明类荧光染料等应用较为广泛［6］，随后碳菁型pH荧光探针等更新的荧光探针不断被开发出来［39］，使得该法的组织细胞pH成像更加清晰。然而，用于检测细胞内酸性器官（如溶酶体、内涵体等）的理想的pH探针目前几乎没有，因此影响了该法在生物医学应用上的发展。

4　小结

MRI因其无创性及可获取组织细胞其他代谢活动信息的优势，迅速而广泛地应用于临床，为疾病的诊断和疗效评价等做出了突出的贡献。从最早可测定组织细胞内pH值的31P-MRS，到后来兴起的CEST成像技术及其分支APT成像技术，因此结合了物理学、化学和生物学的MRI技术当之无愧地成为目前生物医学和临床医学领域最受瞩目的技术方法，前景广阔［40］。虽然微电极法和荧光光谱法测量pH值在临床上的应用远不如MRI法，但相对于依赖MR设备等硬件设施的MRI法，这两种方法在普通实验室的应用却更为广泛，并且在研究单细胞等方面拥有特殊优势。

总之，准确测定组织细胞内外pH值具有重要意义，尤其是在活体情况下进行的测定。本文所介绍的这些测量方法各有其优缺点，进行相关实验时，研究者要熟悉所选方法的原理，选择合适的技术方法，并且在实验过程中注意扬长避短，以帮助实验的顺利进行。

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（收稿2015-09-09）

Research progress in methods of pH measurement in tissue cells

WU Peiqi1，2，LIANG Changhong2.1 Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2 Guangdong General Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences

As an important parameter of body fluid，the hydrogen-ion concentration closely related to the function of tissue cells.Thus accurately measuring the pH，inside or outside cells，is very important for early diagnosis and treatment. The most commonly used methods which can measure the pH of tissue cells include magnetic resonance，microelectrodes，and fluorescence spectrometry.We summarized the principle，advantages and disadvantages for each method，and introduced the research and application progress，aiming to provide some references for related experimental study.

PH measurement；Magnetic resonance spectroscopy；Chemical exchange saturation transfer；Amide proton transfer；Microelectrodes；Fluorescence spectrometry

国家自然科学基金（81271654），NSFC-广东联合基金（U1301258）

10.19300/j.2016.Z3717

R445.2

A

1南方医科大学，广州 510515；2广东省人民医院 广东省医学科学院

梁长虹，E-mail：cjr.lchh@vip.163.com

*审校者