MIN6细胞系的细胞学特性及其应用

冯俊杰 戴阳丽 王秀敏

·综述·

MIN6细胞系的细胞学特性及其应用

冯俊杰 戴阳丽 王秀敏

MIN6细胞系是从表达类人猿病毒40大T抗原(受胰岛毒启动子控制)的转基因非肥胖糖尿病小鼠胰岛瘤中建立的，其内分泌功能与胰腺组织非常接近，是研究胰岛细胞功能的理想模型。MIN6细胞系可用于胰腺分泌的研究，β细胞的适宜刺激信号的探索；1型糖尿病发病机制的研究；氧化应激、自噬、游离脂肪酸对2型糖尿病发病的影响；在胰腺移植后发生排斥的机制研究。

MIN6；糖尿病；细胞学特性；自噬

由于人原代胰岛细胞获取困难，且不能连续传代，所以多选用体外培养胰岛β细胞的细胞株作为替代，常用的有大鼠胰岛β细胞瘤细胞株(RINm5F)及仓鼠胰岛β细胞(HIT-T15)。其在胰岛素基因的研究中广泛应用，缺点是胰岛素分泌远低于正常胰岛细胞，且葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)也与β细胞有所不同，故不能完全替代正常β细胞。小鼠胰岛素瘤细胞(MIN6细胞系)是从小鼠胰岛β细胞瘤或胰岛细胞瘤中分离得到的永久细胞系，它保留了胰岛细胞的GSIS，对脑型葡萄糖转运蛋白(GLUT)不敏感，而特异地对肝型GLUT敏感，可以反映胰岛β细胞的功能变化，是研究胰岛细胞功能的理想模型。以下就MIN6细胞系的细胞学特性及其在研究中的作用作一综述。

1 MIN细胞系的制备和功能

MIN6细胞系是从胰岛素启动子控制下的表达类人猿病毒40大T抗原的转基因非肥胖糖尿病小鼠胰岛瘤中建立的[1]。将这些小鼠喂养至13周处死，切除肿瘤后获得肿瘤细胞，经过单独洗涤，加入DMEM培养基后在培养箱内传代培养。2周后，得到紧密排列、密集生长的细胞克隆，用胰蛋白酶常规消化后进行细胞传代。最终得到两个细胞系：从IT6模型小鼠的肿瘤细胞中得到单一细胞克隆即是MIN6细胞系，而从IT7模型中获得的是MIN7细胞系。MIN6细胞系经孵育12 h后，取上清液，离心去除细胞碎片，储存于-20℃。MIN6细胞系的GSIS与胰岛细胞基本相似，是一种被广泛使用的β细胞系。Nakashima等[2]发现，MIN6细胞还可分泌胰高血糖素、生长抑素和ghrelin，提示其是体外代替胰岛组织培养的较好的细胞系。

2 MIN6细胞系的细胞学特性

MIN6和MIN7细胞系都是由类人猿病毒40大T抗原启动子所激发而得到的，两者都呈均匀形态、集落生长，有一定的神经内分泌功能，包含较高水平的胰岛素mRNA和类人猿病毒40T抗原mRNA。免疫组化分析也提示它们是由同一种胰岛β细胞分化演变而来。但两者的GSIS不同，MIN6细胞系分泌胰岛素的量随血糖升高而显著升高，这与体外培养的正常胰岛细胞基本相似。它们都能产生较高水平的肝型GLUT mRNA，MIN6细胞系只能产生少量的脑型GLUT mRNA。故MIN6细胞系在功能上更接近于胰岛β细胞。

MIN6细胞系保留了β细胞特性，可以在血糖和其他促分泌因素刺激下分泌胰岛素。但是MIN6细胞在多次传代后会发生基因改变，从而失去分泌胰岛素的能力，这些基因的改变包括下调某些基因如磷脂酶D1和胆囊收缩素。多次传代的细胞对某些蛋白也会出现低表达，包括参与内质网应激和活性氧簇生成的抗氧化酶。GLUT是葡萄糖通过细胞膜的重要受体，其中GLUT9和GLUT2也参与了GSIS[3]。既往研究发现，传代次数不多的MIN6细胞系GLUT2的表达几乎没有差异，与多次传代的MIN6细胞系相比较，在基因和蛋白水平的表达均有改变，但是不影响代谢结果[4]。近年来Yamato等[5]发现，MIN6亚群C4更好的保留了GSIS能力，更适用于体外胰岛β细胞系研究。

MIN6细胞系不仅可以分泌胰高血糖素样肽-1，其信号可以通过一种自分泌方式被放大，从而维持其胰岛素分泌的功能[6]。这是MIN6细胞系生存和分泌胰岛素的基础。

3 MIN6细胞系的临床应用

3.1 测定胰腺分泌的激素 胰腺组织有5种内分泌细胞：分泌胰高血糖素的α细胞，分泌胰岛素的β细胞，分泌生长抑素的δ细胞，分泌胰多肽的γ细胞，分泌ghrelin的ε细胞。它们共同维持血糖的稳定。MIN6细胞系可分泌以上5种激素[2]。Nakashima等[2]发现MIN6细胞系可以表达Pdx1，NeuroD，Nkx6.1，Nkx2.2，Pax6，Ngn3，Pax4，Bran4和CckBr等基因，而这些基因同样也在胰岛中表达。

3.2 在氨基酸研究中的应用 某些氨基酸，如L-谷氨酸和L-精氨酸，是胰岛β细胞的适宜刺激信号。研究发现，在接受L-谷氨酸和L-精氨酸刺激后，MIN6细胞内三磷酸肌醇和Ca2+浓度均显著上升，这有助于了解Tas1R家族的表达情况[7]。所以，可以利用MIN6细胞系表达氨基酸受体作相关研究。

AMP活化蛋白激酶(AMPK)是反映细胞状态的传感器，其活化影响了胰岛β细胞的GSIS。哺乳动物的AMPK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其功能是灭活葡萄糖。MIN6细胞系中，蛋白激酶A使AMPKα1 Ser173、Ser485和Ser497位点磷酸化，通过上游激酶活化而阻碍了Thr172磷酸化[8]。蛋白激酶B则使AMPKαS485位点活化，并抑制肝激酶B1(LKB1)的Thr172磷酸化，从而减少AMPK的活化。但使用INS-1β细胞系在研究过程中得到不同结果，蛋白激酶B引起AMPKαSer485位点发生磷酸化，阻止了LKB1Thr172的磷酸化，由于AMPK-LKB1间的级联反应而降低了AMPK的活性。出现这种矛盾的结果可能与使用不同的细胞系有关[9]。王威等[10]发现，MIN6细胞系对血糖的调节能力优于INS-1细胞系。

3.3 在糖尿病发病机制研究中的应用

3.3.1 1型糖尿病 1型糖尿病是一种具有严重炎性反应的慢性自身免疫性疾病，由于胰岛β细胞大量破坏引起胰岛素分泌不足，导致机体糖代谢紊乱[11]。通过对MIN6细胞系的进一步研究发现，miR-146、miR-21、miR-34a在白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α等诱导的β细胞功能衰竭中有重要作用，而miR-34、miR-146a能保护MIN6细胞免受细胞因子诱发的死亡，提示微小RNA异常可能引起自身免疫反应，从而导致1型糖尿病[12]。曹朝晖等[13]的研究认为，caspase-3激活与MIN6细胞凋亡有关，炎性反应因子可能通过激活凋亡相关蛋白诱导细胞的凋亡，这其中可能涉及细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径的信号转导。以MIN6细胞系为例，对1型糖尿病的发生有一定的意义。

3.3.2 2型糖尿病 代谢综合征是2型糖尿病的高危因素之一，Ding等[14]通过对MIN6细胞系的研究发现，木犀草素可以通过核因子-κB-诱导型一氧化氮合酶-一氧化氮途径调节转录因子MafA的表达，而该途径是高尿酸作用于胰岛β细胞的关键，由此降低高尿酸相关性代谢综合征的发生几率，进而降低高尿酸相关性糖尿病的风险。硫化壳寡糖可以对抗过氧化氢对MIN6细胞系的损害，其机制可能是增强了抗氧化酶的活性，并抑制胞内活性氧簇产生[15]。生理条件下，自噬主要受外源性营养物质的调节，当机体处于饥饿状态时，自噬活性增加。同时，自噬也是机体消除错误折叠的大分子、衰老及失能的细胞器的一种途径。自噬与2型糖尿病有潜在的关系，作为机体防御机制可清除失能细胞器导致的氧化应激和内质网应激[16]。胰岛素能抑制自噬，通过激活mTOR依赖性信号通路，与靶细胞表面胰岛素受体结合诱导自身磷酸化，最终使ULK1-Atg13-FIP200复合体失去活性，从而抑制自噬[17-18]。而2型糖尿病患者由于胰岛素抵抗，相关作用减弱，最终导致细胞自噬增强。杜世春等[19]发现，晚期糖基化终末产物可以抑制MIN6细胞活力，并使细胞内活性氧簇的生成增加，诱导MIN6细胞氧化应激，从而影响胰岛素分泌。

RIP140是代谢性核受体辅助因子家族中的一员，主要作为抑制因子调控肝脏、肌肉及脂肪中的糖、脂代谢。2型糖尿病患者外周血单核细胞中RIP140的表达较正常明显升高。敲除小鼠RIP140基因能改善高脂饮食条件下的胰岛素抵抗、增加胰岛素刺激时的糖摄取，同时还可以抑制年龄和饮食诱导的糖耐量异常的发生。下调RIP140表达能够通过上调能量消耗相关基因来改善细胞内氧化应激水平。薛君力等[20]通过利用H2O2建立了MIN6细胞的氧化应激损伤模型，并利用RNA干扰下调MIN6细胞中的RIP140表达，观察到以RIP140为靶点可以调控β细胞损伤。

3.3.2.1 β细胞胰岛素分泌 β细胞分泌胰岛素是一个双相的过程。第一时相发生较快，在血糖变化后10 min之内，分泌高峰在1～2 min。第二时相出现较晚，但持续时间较长，峰值在25～30 min。2型糖尿病患者最初第一时相受损，但保留了第二时相的功能。故是否存在第一时相的损害是预测1型和2型糖尿病风险的因素之一。通过对MIN6细胞的观察，多次传代的MIN6细胞形态不均匀，失去了第一时相功能，GSIS完全受损，胞内ATP明显减少，葡萄糖吸收、氧化和脂质氧化也减少，糖酵解基因和脂质处理基因包括Srebp1c表达降低，导致Sirt3和Nampt基因表达降低，乳酸含量减少，一些脂类合成基因也出现了低表达，包括重要的转录因子Srebp1c。这也使得GLUT1明显下降，GLUT2也有下降的趋势。已知ATP/ADP比值上调是β细胞释放胰岛素所必须的，其可能会通过提高吸收葡萄糖并氧化来提高ATP[4]。

3.3.2.2 游离脂肪酸(FFA)的毒性作用 FFA对β细胞有细胞毒性作用。高水平FFA可以导致内质网的钙离子耗尽，而β细胞需要钙离子的储备。故β细胞对内质网应激非常敏感，钙离子缺乏会诱导其凋亡。棕榈酸诱导的MIN6细胞凋亡与尿酸相关性代谢综合征内质网应激有关。脂肪酸可以激活G蛋白耦联受体40(GPR40)，提高胞内游离钙离子，并可以促进GSIS。持续高水平的FFA使β细胞受到破坏，并可能通过GPR40导致胞内钙离子功能紊乱。GPR40基因敲除小鼠在高脂饮食条件下对肝脂肪变性、高甘油三酯血症和其他一些糖尿病相关性疾病有抵抗，GPR40过度表达可以导致小鼠出现糖尿病表型。实验证明饱和脂肪酸如棕榈酸可导致β细胞凋亡，而GPR40拮抗剂DC260126在48 h内可以呈剂量依赖方式保护MIN6细胞避免被诱导凋亡。提示GPR40参与了棕榈酸诱导的MIN6细胞凋亡[21]。人类白血病相关基因16可以调节MIN6细胞系的胰岛素分泌和GSIS，其过表达还可以加强MIN6细胞系对脂毒性的抗凋亡作用，而ghrelin则可以通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途径对MIN6细胞系起到相同的作用[22-23]。

3.4 胰腺移植后排斥 雷帕霉素(西罗莫司)是一种胰腺移植术后常用的免疫抑制剂，但是长期使用这种药物的患者胰岛细胞功能和活力会受损。对胰腺移植失败的患者进行尸检，没有发现移植的胰腺发生了自身免疫或同种免疫性损害，提示移植失败是由非免疫性因素所导致的，如药物毒性。对MIN6细胞的实验结果表明，雷帕霉素的药理作用是通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)完成的，mTOR存在两个配体，mTORC1和mTORC2。mTORC1对雷帕霉素高度敏感，而mTORC2则不敏感。研究发现，雷帕霉素对MIN6细胞系的功能及寿命均有有害影响。链唑霉素可以诱导β细胞出现细胞凋亡，蛋白激酶B通过介导胰岛素的抗凋亡因子如胰岛素样生长因子-1和胰高血糖素样肽-1，保护了β细胞。蛋白激酶Bα基因敲除的小鼠出现β细胞数量下降，而蛋白激酶Bβ基因敲除小鼠出现β细胞质量下降，两者都可导致凋亡增加[24]。提示雷帕霉素引起的损害是由mTOR2抑制介导的。

综上所述，MIN6细胞系是从小鼠胰腺肿瘤细胞得到的一个细胞系，其来源于胰岛β细胞，与胰腺组织功能上较为相近，是研究胰腺功能的较好的一种细胞系，在糖尿病研究等领域有着较为广泛的应用。

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CytologicalcharacteristicsandapplicationofMIN6cellline

FengJunjie,DaiYangli,WangXiumin.

DepartmentofEndocrinology,TheChildren′sHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,CHina

Correspondingauthor:WangXiumin,Email:wangxiumin1019@126.com

MIN6 cell line is established from insulinomas obtained by targeted expression of the simian virus 40 T antigen in transgenic non-obese diabetic mice. The endocrine function of MIN6 cells is similar to pancreatic tissue, which makes it an ideal model in researching the function of islet cells . The MIN6 cell line is used in pancreatic secretion in recent years, and also in finding stimulus signal to β cells. MIN6 cell line is used to study the pathogenesis of type 1 diabetes as well as the effects of oxidative stress, autophagy and free fatty acids on the pathogenesis of type 2 diabetes. At the same time, it can be used to discuss the mechanism in reject reaction after pancreas transplantation.

MIN6；Diabetes mellitus；Cytological characteristics; Autophagy

国家自然科学基金资助项目(30971125，81370930)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.014

310003 杭州，浙江大学附属儿童医院内分泌科(冯俊杰，戴阳丽，王秀敏)；314001 浙江省嘉兴市第一医院儿科(冯俊杰)；200127 上海儿童医学中心(王秀敏)

王秀敏，Email：wangxiumin1019@126.com

FundProgramThe National Natural Science Foundation of China(30971125, 81370930)

2015-05-27)