DNA去甲基化与间充质干细胞的分化调控

赵洪良　张翠萍　陈 艳　赵换军　谭志军　付小兵（1.解放军医学院01级博士研究生，北京 10085；.解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 10008；.北京军区总医院药理科，北京 100700；.天津医科大学研究生院，天津 00070）



DNA去甲基化与间充质干细胞的分化调控

赵洪良1，2张翠萍2陈 艳3赵换军4谭志军4付小兵2
（1.解放军医学院2012级博士研究生，北京 100853；2.解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 100048；3.北京军区总医院药理科，北京 100700；4.天津医科大学研究生院，天津 300070）

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种重要的多能干细胞干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为多谱系细胞，如心肌、骨、软骨、肌肉和脂肪等多种组织，因其可用于修复损伤组织及治疗某些遗传缺陷性疾病而具有广阔的临床应用前景，所以近年来成为基础和临床医学的研究热点,并取得了丰硕的成果[1]。间充质干细胞分化过程中其形态发生需要经历两个阶段；第一阶段是MSCs确定向成骨、成软骨、成肌和成脂4个谱系中的一个发展，并且失去分化成其他谱系的能力。第二阶段是定向前体细胞表现出相应谱系成熟细胞的特征[2]。这个分化过程受到一连串的组织特异性转录因子和生长因子调节。以DNA去甲基化为先导，调节MSCs形态发生过程中关键节点转录因子的有序表达，可以产生多谱系的组织，包括骨、软骨、肌肉、脂肪和骨髓基质等，由此可见，DNA去甲基化是MSCs细胞分化过程中起到了关键的调控作用。此外，DNA去甲基化相关药物的研究进展迅速，临床应用范围不断扩大，已经取得较好的效果。本文对近年来DNA去甲基化与MSCs分化调控的基础研究及临床应用综述如下。

1　DNA去甲基化

DNA去甲基化是指已经发生甲基化的5-甲基胞嘧啶被胞嘧啶代替的过程，DNA去甲基化主要有两种方式：被动去甲基化和与复制有关的去甲基化，其可能存在多种机制，如碱基切除修复、脱氨酶、核苷酸外切、氧化或水解等导致DNA去甲基化[3-4]。DNA甲基化对于维持细胞分化的高度稳定性具有重要的作用，由于DNA去甲基化,而使其使沉默的染色质转变为激活状态。

1.1DNA去甲基化在成肌细胞分化中的作用被动去甲基化可以解除基因转录沉默状态导致组蛋白去乙酰化，使染色体变得松散，并促进基因活性功能增加[4]。 MSCs分化为骨骼肌细胞的程序就是受到全身低甲基化状态和某些特异性位点低甲基化的调控[5]。在分化开始的第一阶段，成肌调节因子(myogenic regulatory factors, MRFs)发生去甲基化调控肌肉特异性基因的转录活性，而成肌分化因子(myogenic differentiation,MYOD)和成肌因子5的作用是唤醒MSCs向成肌细胞转化[6-7]。进入第二阶段后，核心因子的去甲基化是在甲基化结合蛋白(methyl-binding domain protein2b,MBD2b)的作用下发生的，这会加速成肌细胞的终末分化。继发于去甲基化的MRFs、肌细胞生成素(myogenin, MYOG)、MRF4 (也被称为MYF-6) 驱动定向成肌细胞的增殖并最终分化为肌细胞或者肌管[7-9]。.此外，肌肉结构基因α-actin发生去甲基化后表达增强与肌管的形成增加有关。

1.2DNA去甲基化在成骨细胞分化中的作用定向的成骨细胞前体细胞在形成软骨细胞之前，一些系列的去甲基化基因编码关键基因转录因子对软骨细胞谱系的定向分化和成骨特异性基因表达有重要作用[10]，例如去甲基化调节成骨基因有SRY盒因子9（SRY box-containing factor 9，SOX9）和Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）。其中RUNX2 通过大量的共同激活和抑制因子来转换诱导多潜能MSCs定向进入成骨途径，并通过RUNX2表达升高抑制非定向骨-软骨祖细胞的软骨潜能，触发成骨细胞在分化早期的大多数成骨诱导基因表达，以及增加未成熟成骨细胞的数量[11-12]。此外，还有一个重要的参与者是转化生长因子 -β（transforming growth factor-β， TGF-β）,它通过激活SOX9促进MSCs向成骨分化[13]。之后，软骨调节素-I (chondromodulin-I，CHM1)、软骨粘连素(chondroadherin，CHAD)、成纤维细胞生长因子受体-3 (fibroblast growth factor receptor-3，FGFR3)、α1(II)胶原[α1 (Ⅱ) collagen] 和 α1(X)胶原[α1(X) collagen] 等CpG富集软骨细胞表型相关的基因启动子发生去甲基化[13]，促使相关基因活化。MSCs的成骨分化也依赖于成骨诱导转录因子和大量骨谱系定向基因的继发表达[13]，这些基因有远端缺失同源盒5(distal-less homeobox5,DLX5)、 RUNX2、 BGLAP[bone gammacarboxyglutamate (Gla) protein] 和OSX (osterix)，它们在骨分化起始被去甲基化以促进MSCs向特异性成骨分化[14]，而且成骨细胞的成熟过程通过骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2， BMP2）和OSX介导。此外，大量与成骨分化有关的基因启动子区域被去甲基化以便于成骨细胞逐步获得骨细胞表型，这些启动子包括骨钙素(osteocalcin, OC)、 骨桥蛋白(osteopontin, OPN)、 碱性磷酸酶和I型胶原。

1.3成脂细胞分化的DNA去甲基化调控主转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma, PPARγ）和 C/EBPα （CCAAT/enhancer binding protein alpha） 是 成 脂分化过程中重要的转录因子。外源性表达的PPARγ和C/EBPα能使成肌细胞转分化为脂肪细胞。启动子去甲基化促进成脂谱系定向分化和阻止向非脂肪转化。同样，大量脂肪相关基因如瘦素(leptin)、 脂肪酸结合蛋白4 (fatty acid-binding protein 4,FABP4)、 脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase ，LPL)和葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT4) 的低甲基化使其蛋白得到相应的表达，继而增强脂肪分化[12]。

2　DNA去甲基化调控干细胞分化在表观遗传治疗中的应用

成体干细胞的细胞分化关键是增殖能力改变和获得新的细胞表型。重要的是，这些分子过程的调控可以通过DNA去甲基化实现，从而防止与谱系无关的基因表达或出现非分化特性成体细胞。新的证据表明，表观遗传编程机制对疾病的病因能发挥更大的作用。由于表观遗传修饰比基因异常更容易被逆转，它成为疑难疾病的解决方案之一。在这种情况下，改变人体组织中的多能干细胞的表观遗传学已经成为各种疾病临床治疗应用的一个有吸引力的手段。

2.1血液系统疾病通过DNA去甲基化而使甲基化诱导的基因沉默被逆转是干细胞重新编程用于治疗血液系统疾病的重要机制[14-16]。研究表明，骨髓增生异常综 合 征（myelodysplastic syndromes，MDS） 的 治疗可以通过一些基因低甲基化来实现，如β-连环蛋白启动子、特异相关基因，肿瘤抑制基因p16，p15，上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase ，MGMT）。造血干细胞磷酸肌醇磷脂 酶 Cβ1（phosphoinositide-phospholipase Cβ1，PI-PLC-β1）基因启动子的去甲基化与上述基因的激活和表达增加有关，从而提示了MDS治疗的潜在靶点。对于人类白血病患者，造血干细胞中许多基因启动子的甲基化损害了造血细胞的分化，包括急性髓系白血病的CCAAT增强子结合蛋白-α（CCAAT/enhancer-binding protein alpha， CEBP -α）的甲基化，慢性粒细胞白血病的cellular-abelsongene l癌基因的甲基化，单核细胞白血病的骨形态发生蛋白4（BMP4）、降钙素相关多肽α、细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂2B和视黄酸受体β的甲基化。因此，治疗这些恶性肿瘤的有效手段可能涉及这些造血干细胞中基因的去甲基化，从而为干细胞正常分化铺平道路[17-19]，这一方法为这些疾病的治疗提供了新的措施。

2.2骨、软骨及肌肉相关疾病DNA去甲基化调节MSCs的成骨分化技术的出现，被认为是软骨组织工程、骨组织的改建以及局部或全身性疾病的基因疗法的复兴。因为MSCs具有成肌分化能力,所以它可用于治疗许多肌肉相关性疾病。Duchenne型肌营养不良症（DMD）是一种致命的骨骼肌坏死性疾病，特点是抗肌萎缩蛋白缺乏。在MSCs中的胚胎肌程序关键调节基因的强制表达，如myod1和PAX3的表达，可通过DNA去甲基化实现，被认为是肌肉再生的一个很有前途的措施[20]。关节透明软骨的再生能力差，而MSCs作为靶细胞可有效地修复半月板或关节软骨细胞，或使其再生，并可阻止过早软骨肥大，这是通过特异性成软骨基因例如CHM1、 CHAD、 FGFR3、 α1（Ⅱ）胶原和α1（X）胶原的低甲基化实现的[21-22]。MSCs还可用于治疗成骨不全。MSCs被编程后，通过低甲基化来表达Ⅰ型胶原基因，然后应用于患者，造成成骨谱系的祖细胞体内增殖，从而治疗成骨不全[23]。

2.3神经疾病和糖尿病DNA去甲基化诱导神经干细胞在体内分化为神经前体细胞，然后进行神经干细胞移植，这是当前探索脑肿瘤、缺血性痉挛性截瘫、慢性脊髓损伤和慢性中风的未来的治疗手段[24]。通过DNA去甲基化介导的分化措施，由原始内胚层多能干细胞最终产生功能性胰岛素β细胞，从而提供了新的胰岛素来源，有望成为治疗糖尿病的方法。这些措施为大量神经退行性疾病和糖尿病患者带来了新的希望[25]。

3　展 望

随着表观遗传修饰在发育、细胞分化、细胞稳态维护、维持基因完整性和在许多疾病进展中体现的作用，去甲基化必然会越来越受到重视。尽管去甲基化仍然有许多悬而未决的问题，例如，哪个基因的去甲基化决定了受精卵的全能性干细胞分化为定向体细胞？内在因素和/或外在因素如何激发去甲基化从而刺激胚胎发育继而器官的发生？低甲基化的不同状态是如何被其他因素如组蛋白修饰或者染色质重组影响的？这些问题的研究对于阐明MSCs的分化机制具有重要的意义。

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DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 020

(收稿日期：2015-06-25)