基因突变与骨髓增殖性肿瘤关系的研究进展

王朋，秦松，柳长柏，王君，邹黎黎

(1.三峡大学人民医院转化神经科学&神经再生修复实验室，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学细胞治疗研究所肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002)

基因突变与骨髓增殖性肿瘤关系的研究进展

王朋1，2，秦松1，2，柳长柏1，2，王君1，2，邹黎黎1，2

(1.三峡大学人民医院转化神经科学&神经再生修复实验室，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学细胞治疗研究所肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002)

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是因为骨髓髓系细胞增殖导致外周血细胞计数增加的克隆性造血干细胞疾病。经典的Ph染色体阴性MPN由真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)及原发性骨髓纤维化(PMF)组成，研究发现PV、ET及PMF的发病机制与多种基因的突变密切相关，包括Janus激酶2(JAK2)、促血小板生成素受体的编码基因MPL及钙网蛋白CRT。因此，本文着重以JAK2、MPL及CRT的突变介绍基因突变与MPN的关系的最新研究进展。

骨髓增殖性肿瘤；Janus激酶2；促血小板生成素受体编码基因MPL；钙网蛋白

骨髓增殖性疾病(Myeloproliferative disorder，MPD)属于造血干/祖细胞恶性克隆性疾病，是由于骨髓中一系或多系造血细胞过度增长，导致外周血中一种或多种血细胞形态和功能正常的计数增加，此概念由Dameshek等[1]于1951年第一次提出。2008年，WHO将MPD更改为慢性骨髓增殖性肿瘤，并将其分类到造血和淋巴肿瘤疾病[2]。典型MPN可分为慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)、真性红细胞增多症(Polycythemia vera，PV)、原发性骨髓纤维化(Primary myelofibrosis，PMF)和原发性血小板增多症(Essential thrombocythemia，ET)[3]，随病程进展部分可转化为其他疾病或各亚型之间相互转化。MPN发病机制复杂，2005年之前仅有CML的发病被明确证明与Ph染色体密切相关，其余Ph阴性的MPN的发病机制尚不明确，且没有特异性的分子诊断标志；但自2005年起，陆续有研究发现MPN患者中存在Janus激酶2(Janus Kinase 2，JAK2)、促血小板生成素受体的编码基因MPL及钙网蛋白(Calreticulin，CRT)的基因突变，且这些突变与MPN之间存在着密切的关系。

1 JAK2突变

Janus激酶(Janus kinase，JAK)属于非受体型酪氨酸蛋白激酶，由JAK1、JAK2、JAK3及TYK2(Tyrosine kinase)构成，其中，JAK2基因位于9p24，由7个高度保守的JAK同源结构域(JAK homology，JH)组成[4]。羧基端包括JH1酪氨酸蛋白激酶区及JH2激酶相关区，氨基端含有FERM结构域(JH3-JH7)，其功能是为与JAK2相互作用过程中的各种信号通路提供结合位点。值得注意的是，JH1是具有酪氨酸激酶活性激酶结构域，JH2结构域有正常激酶结构却无激酶活性，但在正常生理情况下自动抑制JAK2酪氨酸激酶活性，对JH1激酶活性产生负调控作用[5]。下游信号只有经过细胞生长因子的刺激才可产生从而使造血细胞增殖、分化。一旦JH2结构域发生变化，其自身对JH1抑制功能解除，JAK2酪氨酸激酶持续活化，受体持续磷酸化，导致造血细胞持续增殖、分化，从而引发一些高表达疾病。

JAK2突变发生在JH2结构域，原本位于12号外显子中1849位鸟嘌呤G突变为胸腺嘧啶T，导致JAK2蛋白激酶结构域中蛋白质错义编码，617位缬氨酸转变为苯丙氨酸[6]。JH2的自我抑制功能丧失，导致JAK2持续活化，使其在缺少配体的情况下与受体结合[7]，激活下游信号通路，导致造血细胞克隆性增殖，引起外周血细胞计数增加[8]。James等[9]对MPN患者进行基因学分析，于74例MPN患者(45例PV，17例ET，12例PMF)发现52例(40例PV，3例ET，9例PMF)存在JAK2 V617F突变，而对照组并未检测到突变，并证实突变的JAK2可不依赖配体自发激活下游STAT信号通路。且发现在细胞生长因子刺激缺失的条件下，EPK/MAPK(Mitogen-activated protein kinase)和P13K/AKT通路能被激活，这些改变使凋亡减少，恶性细胞过度增殖。此现象表明，当存在JAK2 V617F突变时，MPN的发病机理与JAK2的抑制能力的丧失具有高度相关性，Levine等对MNP患者进行基因水平充分细致的研究，采用高通量基因测序法对JAK2进行测序，发现MPN患者存在V617F突变[4]；Quentmeier等[10]在对MPN致病机理进行充分研究后发现，MPN致病过程包括原癌基因(JAK2V617F)的激活和抑癌基因(细胞因子2抑制剂，suppressor of cytokine signaling-2，SOCS2)的失活。

Baxter等[6]也调查证实，JAK2 V617F突变发生在97%的PV患者、57%的ET患者和50%的PMF患者中。Vainchenker等[11]发现2%～3%的PV患者不存在V617F等位基因的突变，却含有JAK2的12号外显子突变，JAK2V617F阴性的ET和PMF患者占大约40%。其中，3%～8%与促血小板生成素受体的编码基因突变有关。

2 MPL突变

人血小板生成素(TPO)受体(TPOR)的编码基因MPL位于染色体1p34上，其编码的蛋白存在于细胞质，细胞膜及细胞外。其中，胞膜区与胞浆区连接处存在一段含有515位色氨酸的兼性K/RWQFP序列，其主要功能是维持MPL的细胞质构象，此序列的缺失会导致在不依赖配体的情况下，下游信号的持续性活化，而515位色氨酸的突变就可导致受体自发激活[12]。在3%～8%的ET患者和PMF患者中存在515位色氨酸的突变[13-14]。氨基酸错义突变导致不依赖TPO受体的活化信号的产生，其机制与MPL二聚体几何构象的改变有关[15]。位于胞膜区与胞浆区连接处的515位色氨酸在正常生理情况下抑制了MPL跨膜区的螺旋及阻止了受体的自发激活[16]。而515位色氨酸突变为其他氨基酸，如亮氨酸、赖氨酸或精氨酸时，其抑制功能丢失导致了MPL持续活化；MPL蛋白表达水平的升高使得巨核细胞生成水平得到上调[17]，从而导致疾病的发生。

综上可知，几乎全部的PV与JAK2(97%与JAK2V617F突变相关，2%～3%与JAK2的12号外显子突变相关)突变相关；大约60%的ET和PMF与JAK2 V617F突变相关，此外3%～8%的ET和PMF与MPL相关。2008年，JAK2和MPL与MPN的密切关系使得WHO成员重新修订了MPN的诊断标准[18]；但是，超过30%的ET和PMF缺乏常用的分子标记，然而，2013年钙网蛋白突变与MPN关系的发现弥补了该空白。

3 CRT突变

钙网蛋白(Calreticulin，CRT)是一种存在于内质网(endoplasmic reticulum，ER)[19]及细胞膜、细胞质和细胞核[20]的多区域多功能性蛋白质，其最初是作为Ca2+结合伴侣分子被发现的[21]。CRT由三个不同的结构域组成，包括一个球形的N端结构域，此结构域含有内质网定位信号的序列；中间的P端结构域，是一个高亲和力、低容量的Ca2+结合位点；一个强酸性的C端结构域，具有高容量、低亲和力的Ca2+结合功能。C端包含一个KDEL序列，含有KDEL序列的蛋白可从高尔基体回到内质网。CRT可与其他内质网相关蛋白(特别是钙连接蛋白)协作干预，以确保蛋白质和糖蛋白的正确折叠。钙网蛋白与钙联接蛋白具有结构同源性，并具有与钙联接蛋白循环相关的功能：即在N聚糖依赖性的蛋白质质量控制过程中确保糖蛋白正确的折叠、降解和防止蛋白聚集[22]。

2013年12月，Nangalia等[23]和Klampf等[24]同时报道了在JAK2和MPL阴性的ET与PMF患者中发现CRT基因的异常突变，其比例占到60%～80%；至此，JAK2，MPL和CRT阴性(三阴性)的ET和PMF比例患者降低至15%以下。CRT的突变表现为：位于9号外显子的插入和缺失，包括52 bp的缺失(Ⅰ型，占所有病例的45%～53%)，和5 bp TTGTC的插入(Ⅱ型，占所有病例的32%～41%)。突变可引起移码，导致一个36个氨基酸序列取代正常C端序列中的27个氨基酸序列，形成了一个新的C末端，导致KDEL序列丢失。

在正常造血过程中，有关CRT突变介导的功能改变的相关报道很少，因此CRT突变是如何参与MPN的发生发展过程的在很大程度上仍然是未知的。但可以肯定的是，CRT突变导致MPN的关键致病因素与JAK/STAT信号有关，Klampfl等[24]研究表明，在白介素Ⅲ依赖性的鼠Ba/F3细胞中CRT del52的表达与STAT5磷酸化的增强相关，并使正常细胞转化为非细胞因子依赖性细胞；此外，JAK2抑制剂可抑制CRT突变细胞的生长，且体外观察与已报导的JAK2抑制剂治疗CRT突变的MPN患者的结果相吻合[25]，其原因可能与细胞内CRT执行多种细胞功能有关。虽然通过CRT突变导致的JAK/STAT信号是异常复杂，但据现有研究表明在MPN中，CRT的突变与细胞功能紊乱具有相关性。

突变的CRT的C端缺乏KDEL序列，增加了细胞错误定位的可能性，从而引起细胞功能的改变。关于突变CRT结构功能关系的生物信息学分析表明，突变的蛋白质的C端失去结合Ca2+的能力，而这又可影响各种细胞功能[26]。此外，CRT/钙联接蛋白的缺陷也可能参与了造血祖细胞谱系的改变，导致巨核细胞谱系的优先扩增[27]。在内质网外野生型CRT定位于细胞质、细胞核、细胞表面及细胞外液。然而，来自于骨髓增生异常综合征患者的白血病祖细胞和发育异常的祖细胞显示，CRT在细胞表面上表达上调；CRT表达在细胞膜上可能释放出一个“吞噬我”的信号，最终被CD47的表达所抵消，从而影响对肿瘤细胞的吞噬作用[28]。然而，在CRT突变的粒细胞，其在细胞表面的CRT含量并没有显著增加[23]。

CRT突变引起的ET和PMF使得MPN的发病机制的研究又向前跨越了一步，CRT使得ET和PMF的可检测性超过85%，CRT突变的发现可显著地影响MPN的实验研究、患者的诊断和管理、预后及治疗方式等。既然2008年WHO修订MPN的分类诊断标准时，将JAK2和MPL的突变作为其主要标准[18]。因此，WHO有理由将CRT突变也纳入MPN的诊断依据，与JAK2突变及MPL突变一起制定新的MPN诊断标准，并以CRT突变为突破点研发CRT抑制剂来治疗CRT突变引起的MPN。

4 展望

JAK2突变的发现使Ph染色体阴性的MPN上升到分子诊断和分子靶向治疗的层面[29]。MPL和CRT突变的发现使得MPN的诊断在JAK2突变的基础上得以完善。随着对它们在MPN中发病机制的深入了解将有助于患者的分型诊断，从而针对这些特异性分子标记物开发出特异性靶向治疗药物，以改进当前的治疗方案，改善患者的预后及生存率。然而，现已对MPN发病的分子机制有了足够的了解，但有些机制还不尽完善，更有少于15%的MPN患者可能存在的基因突变和表观遗传学改变尚不明确；针对JAK2、MPL、CRT等分子水平异常的靶向治疗药物的开发以及药物疗效的确定，尚待下一步深入研究。

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Research development of the relationship between gene mutation and myeloproliferative neoplasms.

WANG Peng1,2,QIN Song1,2,LIU Chang-bai1,2,WANG Jun1,2,ZOU Li-li1,2.1.Translational Neuroscience&Neural Regeneration and Repair Institute/Institute of Cell therapy,People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA;2.Hubei key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotheraph,Cell Therapy Research Institute,China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA

Myeloproliferative neoplasms(MPN)are a group of diseases characterized by increased proliferation of erythroid,megakaryocytic,or granulocytic cells.These disorders are caused by hyperproliferation of multiple hematopoietic lineages in the bone marrow.The Philadelphia-chromosome-negative classic chronic myeloproliferative neoplasms(MPN)include polycythemia vera(PV),essential thrombocythemia(ET),and primary myelofibrosis(PMF). Studies have found that the pathogenesis of PV,ET and PMF is closely related to a variety of gene mutations which including Janus kinase 2(JAK2),MPL and calreticulin(CRT).This paper focuses on the latest research progress of the relationship between gene mutations(JAK2,MPL and CRT)and MPN.

Myeloproliferative neoplasms;JAK2;MPL;Calreticulin

R733.3

A

1003—6350（2016）05—0774—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.030

2015-09-06)

国家自然科学基金（编号：81201766）；湖北省教育厅基金（编号：Q20151204）

邹黎黎。E-mail:zoulili@ctgu.edu.cn；王君。E-mail;wjtianxiafox@163.com