荧光染色法在检测痰中结核杆菌的应用分析

张国斌

荧光染色法在检测痰中结核杆菌的应用分析

张国斌

目的探讨荧光染色法在检测痰中结核杆菌的应用价值。方法80例确诊的肺结核患者,均经深咯痰标本的收集,制作两份痰标本玻片后分别采用抗酸染色法和免疫荧光法对结核分枝杆菌进行检测,比较两种检测方法的检测阳性率。结果采用荧光染色法检测结核杆菌的阳性率50.0%(40/80)高于抗酸染色法的33.8%(27/80),差异有统计学意义(P＜0.05)。荧光染色法检测结核杆菌+、++、+++、++++的阳性率高于抗酸染色法,但差异无统计学意义(P＞0.05)。结论荧光染色法对结核分枝杆菌的诊断率较高,而且方便、快捷,对于肺结核的诊断具有重要意义。

荧光染色法；痰液；结核杆菌

结核病是一种慢性疾病,由结核杆菌感染所引起,主要通过呼吸道传播,属于人类重大的传染病之一。21世纪以来全球每年约出现800万结核新病例,约300万人死亡。我国的结核病流行情况较为严重,同时患者的耐结核药情况也比较严重。绝大多数结核病都是可以治愈的,早期诊断、发现传染源对确定治疗方案,改善患者预后具有积极意义。目前,临床上对结核病的诊断,主要是通过痰涂片镜下检查、病理切片、X线以及细菌培养等。如何快速有效的检查分枝杆菌细菌,发现传染源是检验科值得研究的课题。据相关研究报道,在常见的几种结核病检测手段中,荧光染色试验诊断结核杆菌的阳性率较高［1］。本研究选取本院2015年8月～2016年2月收治的80例确诊的肺结核患者为研究对象,比较荧光染色法与抗酸法的诊断情况,现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2015年8月～2016年2月收治的80例确诊的肺结核患者,符合肺结核诊断标准［2］,诊断为活动性肺结核。其中男44例,女36例,年龄21～75岁,平均年龄(45.9±16.2)岁。

1.2方法 收集患者的一般资料,如临床症状、体征、X线、PPD试验、结核抗体检查、血常规、血生化等检验结果。每例患者均经深咯痰标本的收集,制作两份痰标本玻片后分别采用抗酸染色法和免疫荧光法对结核分枝杆菌进行检测。留取患者清晨痰。用生理盐水漱口后,以清除口腔内的食物残渣及部分杂菌,第一口痰弃去,取深部咳痰三口,合格标本量≥1 ml。将收集到的痰液放入无菌塑料标本盒中,勿将唾液或鼻涕吐入标本盒。将收集到的痰液放置于无菌的密封瓶中,检测前进行相关处理,将一定剂量的胰酶消化液注入到痰液中,进行水浴消化,增强消化效应。之后加入一定剂量的氢氧化钠,采用振荡器混匀,混合10 min。检测时取处理后的痰液标本0.5～0.8 ml,倒入洁净离心试管中以3000 r/min的速度进行离心,时间为10 min。离心处理后选择沉淀部分,取0.1 ml置于载玻片中央处,并均匀涂抹成1.0 cm×2.0 cm椭圆形痰膜,薄厚适中,让其自然干燥后痰涂片火焰固定,置于染色架上。每份痰液制作两份痰标本玻片后分别采用抗酸染色法和免疫荧光法对结核分枝杆菌进行检测。①荧光染色法：首先经制作好的痰涂片放入湿盒中,水洗后用5%的盐酸乙醇脱色1～2 min,外观无黄色为止,水洗。将痰涂片利用荧光素标记抗结核杆菌单克隆抗体对待检的标本进行染色,在LED荧光显微镜下,把物镜焦距调为40×,对结核分枝杆菌的情况进行观察。②抗酸染色法：按《结核病诊断细菌学检验规程》的常规操作方法对结核分枝杆菌的情况进行检查,滴加复红染色剂后加热,出现蒸汽后,3～5 min后水洗。然后使用盐酸乙醇将其脱色,时间控制在10 min以内。脱色后水洗,加亚甲蓝复染30 s,水洗,室温下待干。

1.3观察指标及评定标准 比较抗酸染色法和免疫荧光法对结核分枝杆菌的诊断阳性率。其中抗酸染色标本中分枝杆菌呈红色,其他细胞核细菌呈蓝色。20倍荧光显微镜下,分枝杆菌呈黄绿色,40倍下可观察到分枝杆菌呈杆状或棒状。根据检测结果的不同分为阴性(-)、+、++、+++、++++,两者均以《结核病诊断实验室检验规程》为准。荧光染色抗酸杆菌阴性(-)［3］：每50视野符合0条；荧光染色抗酸杆菌阳性(+)：每50视野有10～99条；荧光染色抗酸杆菌阳性(++)：每个视野符合1～9条；荧光染色抗酸杆菌阳性(+++)：每个视野符合10～99条；荧光染色抗酸杆菌阳性(++++)：每个视野符合≥100条。抗酸杆菌阴性(-)：连续观察300个不同视野,符合0条/300；抗酸杆菌阳性(+)：每100视野符合3～9条；抗酸杆菌阳性(++)；每10视野符合1～9条；抗酸杆菌阳性(+++)：每视野符合1～9条；抗酸杆菌阳性(++++)：每视野符合≥10条。对两种检测方法的检测阳性率进行比较。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

采用荧光染色法检测结核杆菌的阳性率50.0%(40/80)高于抗酸染色法的33.8%(27/80),差异有统计学意义(P＜0.05)。荧光染色法检测结核杆菌+、++、+++、++++的阳性率高于抗酸染色法,但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 荧光染色法与抗酸染色法检测结核杆菌的阳性率比较［n(%)］

3 讨论

肺结核是一个全球公共卫生和社会问题,其病理基础不十分清楚,具有病程长、传染性强的特点。我国的肺结核发病率于近年来有逐渐上升的趋势,面临着较为严峻的局面。对疾病的控制首先面临的问题是结核病的诊断。早期应用快捷灵敏的实验室诊断方法以及发现和治疗肺结核是该疾病控制的关键。结核杆菌属于放线菌目,可侵犯人体的各组织和器官,其中以肺部最为常见［4］。结核杆菌是肺结核的致病菌,早在1882年就由德国细菌学家郭霍所证明。结核杆菌的细胞壁中含有较多脂质,约占细胞干重的60%。细胞染色法成为检测该种杆菌细胞的常用方法。抗酸染色法是全世界结核病实验室都在使用的最基本的细菌学检查方法,该方法操作简单,但检测时间长,而且难以准确反映痰液当中携带的细菌数目,阳性率低,灵敏度和特异性也较差,而且检测结果受标本质量的影响较大［5］。病理检测的准确性高,但细菌培养的特异性和敏感性较低,而且耗时长,在临床早期应用上受到了限制。

随着结核病的分子生物学诊断技术的迅速发展,荧光染色法在结核杆菌的诊断中逐渐推广起来。荧光染色法所检测的是结核分枝杆菌的特异DNA片段,荧光显微镜下观察呈现特异性荧光成像,与蓝黑色背景反差很大,对比鲜明,非常明显容易被发现［6］。该方法检测既不需要进行细菌的培养,也不需要菌体是否有活力,具有操作简单、结果可靠、可定量、灵敏度、重复性和特异性好等特点。而且荧光染色的检测结果在荧光显微镜下进行,可观察的范围更广,更容易进行结果的判读。本研究将荧光染色和抗酸染色对结核杆菌检测的阳性率进行比较,结果发现,荧光法检测的阳性率显著高于抗酸染色,差异有统计学意义(P＜0.05)。而且有研究显示,对疑似结核病的患者进行荧光染色法检测的阳性率也高于抗酸染色法［7］,且荧光染色法的检查灵敏度更高,可为疾病诊断提供较科学的检测依据。

综上所述,荧光染色法对结核分枝杆菌的诊断率较高,而且方便、快捷,对于肺结核的诊断具有重要意义。

［1］张东浩,李影.荧光定量PCR检测痰结核分枝杆菌DNA的应用价值.中国医药指南,2012,10(1):90-91.

［2］陈文彬,潘祥林.诊断学.第7 版.北京:人民卫生出版社,2008: 27.

［3］赵志英,刘振波.不同检测方法对痰液标本中结核杆菌检测效果的比较分析.中外健康文摘,2013,10(18):137-138.

［4］丁瑶,叶琴.金胺O荧光染色法应用效果评价.中国保健营养,2015,25(13):151.

［5］张立,周洪经,冯爽.荧光染色法在结核分枝杆菌检测中的应用.山东医药,2014,54(7):55-57.

［6］杨江华,朱晓玥,王文节.免疫荧光染色法检测结核分支杆菌的建立与临床应用.中国实验诊断学,2015,19(5):775-777.

［7］肖静,杨元好,金瑛.荧光染色法检测痰中结核杆菌的应用.贵阳中医学院学报,2013,35(4):152-153.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.16.008

2016-07-22］

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