miRNA对糖尿病性视网膜病变新生血管因子的调控作用研究进展

巫灵鲜 蒋玲 张家会

彭州市人民医院眼耳鼻喉科 四川省彭州市 611930

miRNA对糖尿病性视网膜病变新生血管因子的调控作用研究进展

巫灵鲜 蒋玲 张家会

彭州市人民医院眼耳鼻喉科 四川省彭州市 611930

糖尿病性视网膜病变是致盲的重要原因，新生血管因子在其发病机制中发挥着重要作用，对新生血管因子的作用进行调控，有可能成为治疗DR的靶点。微小RNA(miRNAs)是一类高度保守、非编码的小分子RNA，通过与靶基因转录的mRNA互补配对在转录后水平调节靶基因的表达。近年发现miRNAs与眼内新生血管的发生发展密切相关。本文就miRNAs的功能以及未来作为治疗的可能手段的前景作为综述。

微小RNA；糖尿病性视网膜病变；新生血管因子

糖尿病性视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，其主要的特征是视网膜微血管功能障碍，最严重的后果是导致失明，它已成为大多数发达国家工作年龄人群致盲的首要原因。研究发现，糖尿病患者比非糖尿病患者发生视力损害的危险性高 25倍, 每年仅在美国就有1,2000－2,4000例患者因DR而失明。DR的发病率随着糖尿病发病率及病程的增加而增加。据估计，美国40岁以上的成年人高达40%的人群患有某种类型的糖尿病，其中8%的患者因DR引起视觉损害。由于DR的发病机制错综复杂，其确切有效的治疗方法也没有最终明确。学者们普遍认为早期有效控制血糖、血压和血脂是治疗DR的关键措施；而激光光凝术是手术治疗DR、预防新生血管形成的有效措施，但这一治疗措施终究是一种破坏性的治疗手段，而且并不能完全有效控制DR造成的视力损害。最近有研究表明miRNAs在血管性疾病、炎症和新生血管形成等方面也发挥着重要作用。miRNAs可以调节血管内皮细胞的功能，对其分化、增殖和新生血管形成产生一定的影响，有望成为治疗DR的新靶点。

1. miRNAs概述

microRNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小RNAs，最初发现的内源性miRNAs是lin-4和lin-7，它参与基因表达后转录调节，通过与靶向mRNAs的3' -UTRs（3'端非编码区）或编码区结合，通过在翻译水平抑制基因表达或在转录后水平降解mRNA的方式参与基因调控与蛋白表达。miRNAs的主要功能是调节生物体内与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。此外miRNAs可以作为触发RNA干扰（RNA interference, RNAi）的分子参与细胞增殖、死亡、凋亡和脂肪代谢。另外，miRNAs还可能与转座的抑制、基因重组有关，可能参与转录和转录后水平的基因表达调控，因此认为miRNAs可能与高等真核生物中调节基因表达的转录因子一样重要。许多人类 miRNAs已经确定具有进化保守性，并且miRNAs靶向作用于人类三分之一的基因，随着对miRNAs的深入研究，有利于对生长发育调控机理和治病机理的理解。

2. DR发病机制

DR早期的病理改变有毛细血管内皮细胞的基底膜增厚，周细胞丧失，毛细血管自动调节功能失代偿，随后出现内皮细胞屏障功能损害，血液成分渗出，毛细血管闭塞，导致广泛的视网膜缺血，引起视网膜水肿。早期的病变进一步发展将导致视网膜广泛缺血缺氧，使视网膜中刺激血管生成的因子和抑制血管生成的因子分泌失衡，引起视网膜新生血管形成，从而发展成为晚期的增殖性糖尿病性视网膜病变(Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR)。新生血管形成是造成PDR患者视力损害和玻璃体积血、视网膜脱落、新生血管性青光眼等眼部并发症的主要原因。关于DR的发病机制仍不清楚，学者们认为除了蛋白质非酶糖基化终末产物的堆积、蛋白激酶C激活、氧化应激学说、细胞因子的作用、肾素-血管紧张素及内皮系统的异常等对 DR的发生发展发挥着重要作用以外，糖尿病病程及其血糖控制情况亦是视网膜病变发生、发展的重要原因之一。然而，许多临床观察显示：有些患者即使代谢控制良好也不能完全预防其发生，有些患者长期处于高血糖状态却不发生视网膜病变；有些患者在糖尿病早期就出现视网膜病变，而有些患者糖尿病病程长达数十年却不发生视网膜病变，这就表明遗传因素在DR的发生、发展中起了关键性作用。因此，对DR的易感基因进行干扰，有可能为DR的治疗提供一种新的思路。

3.miRNAs对新生血管因子的调控作用

3.1 miRNAs对VEGF/VEGFR基因的表达调控

VEGF是一种有效的血管生成因子，通过与其特异性的受体VEGFR结合而发挥作用，可刺激血管内皮细胞分化、移行、增殖和管腔形成，对视网膜色素上皮细胞也有促增殖作用，并可增加血管渗透性。VEGF广泛分布于人和动物体内的脑、肾、肝、眼等多种组织。正常情况下，视网膜周细胞、内皮细胞和视网膜色素上皮细胞内存在较低水平的VEGF，这对维持眼部血管的完整性是必要的，然而VEGF的过度表达将促进血管的增殖。临床及动物实验均已证实，在DR个体眼内特别是视网膜局部存在高水平的VEGF，随着DR病程的延长，其表达量有逐渐增加的趋势，其表达范围也明显扩大。VEGF是促进DR新生血管形成的重要因子之一，其作为血管内皮细胞特异的促有丝分裂素与表面相应受体结合，激活细胞内的一系列信号转导途径，造成内皮细胞增殖、迁移，最终形成新生血管。此外，VEGF/VEGFR基因亦是DR的易感基因，用于编码VEGF、VEGFR，如对该易感基因进行调节将有助于为DR的防治提供新的策略。

近年来，学者们对miRNAs调节VEGF/VEGFR基因的功能已经进行了初步研究。低氧是诱导新生血管形成的重要刺激因素之一。在低氧状态下，血管生成因子如VEGF等表达增加，从而诱导血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成。Hua等发现在低氧状态下，多种miRNAs都可以直接调控VEGF的表达，它们通过协同和竞争的方式共同作用于 VEGF基因。随后，Fish等发现miR-126可以调节VEGF对内皮细胞的作用。内皮细胞在维持血管完整性、新生血管形成和创伤修复方面发挥着重要作用。Wang等发现敲除大鼠miR-126基因后，由于血管完整性受损和内皮细胞增殖、迁移、新生血管形成等功能障碍，从而引起血管通透性增加，出血，甚至造成一部分胚胎死亡。miR-126先天缺失所导致的血管的病理改变和抑制血管生成因子如：VEGF和成纤维细胞生长因子等所导致的病理改变是一样的，由此可见 miR-126可以通过抑制细胞内的 Spred-1（细胞内一种新生血管信号抑制剂）的表达加强 VEGF和 FGF的作用，从而促进血管形成。miR-126基因缺失或功能障碍可能导致一系列的病理性血管形成和功能障碍，这一研究结果有助于为各种异常新生血管形成和血管渗漏导致的疾病提供一种新的治疗方法。此外，Shilo等应用抑制人微血管内皮细胞中Dicer酶的方法阻断miRNAs的成熟过程，从而观察miRNAs对人微血管内皮细胞氧化还原反应的调节作用。结果显示，阻断miRNAs的成熟后，可以降低人微血管内皮细胞在氧化应激状态下产生的活性产物,如VEGF、肿瘤坏死因子-α等。他们认为其主要的作用机制是 miRNAs可以对转录因子HBP1产生负调控，而HBP1是p47phox的一种抑制性转录因子，抑制HBP的表达，将导致p47phox的表达增加，从而使人微血管内皮细胞在氧化应激状态下产生的活性因子的表达增加，进一步诱导人微血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。该试验证明了miRNAs可以调节人微血管内皮细胞内的氧化应激信号传导通路，而还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶复合物的调节基因p47phox是miRNAs调节内皮细胞增殖、迁移和新生血管形成等过程的一个特定靶点。以上研究表明了miRNAs在缺氧状态下对VEGF的表达具有重要的调控作用。

3.2 miRNAs对TGF-β基因的表达调控

TGF-β因具有使正常小鼠成纤维细胞表型发生转化的能力而得名，是由淋巴细胞、血小板、单核细胞和肝枯否氏细胞等多种细胞分泌的一类具有多重生物学效应的因子，广泛存在于动物正常组织细胞和转化细胞中，对细胞的作用因细胞的种类，细胞周围环境和细胞自身状态不同而表现出刺激或抑制效应。TGF-β眼内来源广泛，已知眼前、后段组织中角膜、虹膜、晶状体上皮细胞、小梁网细胞、睫状体上皮细胞和视网膜色素上皮细胞都能合成和分泌。TGF-β可由压力负荷、高血糖、血管紧张素Ⅱ等多种因素刺激产生。DR患者血清中TGF-β含量明显高于健康人群，并随病程延长及眼部病情加重而增高。其参与DR发病机制可能为：（1）促进内皮细胞增殖、粘附、细胞外基质沉积；（2）激活丝裂原活化蛋白激酶，诱导人视网膜色素上皮细胞表达VEGF增加，促进DR新生血管形成；（3）增加纤维连接蛋白的合成，导致血管纤维化。此外，在新生血管的形成过程中，TGF-β参与新生血管的激活、重塑，并扩张存在的血管网，它能抑制内皮细胞的增殖，促进间质细胞向血管聚集，并向周细胞和平滑肌细胞分化，抑制内皮细胞(Edothelial cells, ECs)增殖。它同ang2、Tie2一起，在新生血管的重塑和维持血管的稳定中发挥作用。

目前有研究表明miRNAs对TGF-β信号通路具有一定的调控作用，同时TGF-β也可影响miRNAs的表达。首先Sun等研究表明 TGF-β可以通过调节 miR-24促进骨骼肌细胞分化，他们发现在骨骼肌细胞分化的过程中 miR-24的表达上调，同时TGF-β可以抑制miR-24的表达，TGF-β是通过抑制smad3和miR-24启动子区域smad的结合位点而发挥作用的。随后，Zavadil等研究发现TGF-β可以通过直接调控miRNAs的表达而影响上皮细胞的功能。有关糖尿病时miRNAs的调节作用研究尚少，最近 Kato等研究报道在糖尿病肾病时 miRNA-192可以通过抑制E-box受体从而调控TGF-β诱导的胶原表达。miRNAs在糖尿病肾病时对 TGF-β调控机制目前还不清楚，但是初步的研究表明miRNAs在糖尿病肾病的发生发展过程中发挥着重要的调控作用。DR和糖尿病肾病一样都是糖尿病重要的微血管并发症，他们之间存在着很多相似之处，因此，因此，有学者推测miRNAs在DR时也对TGF-β的表达发挥着一定的调控作用或通过某种机制影响TGF-β的生物学功能。

3.3 miRNAs对Ang-2/Tie-2信号传导系统的调控

血管生成素（angiopoietin,Ang）是血管调节因子，分为Ang-1和Ang-2两种。Ang1可增强血管内皮细胞和周细胞的连接，稳定血管构造。Ang-2是Ang-1的拮抗体，使周细胞游离，引起血管构造不稳定，在VEGF存在时促进血管新生。Ang-1和Ang-2均是通过和其受体Tie-2结合而发挥作用的。目前，有许多研究结果表明，Ang/Tie-2系统很可能在视网膜新生血管发生和形成中发挥重要作用。Hackett等报道无论是在胚胎视网膜发育阶段或是成人视网膜病理性新生血管形成阶段，视网膜表面和内核层Ang-2表达都增高，提示Ang-2能辅助VEGF促进视网膜新生血管形成。Umeda等研究也显示：早产儿视网膜病变的视网膜纤维血管膜中有Ang-2,Tie-2的mRNA表达升高。转基因Ang-2缺陷鼠，不可能诱导视网膜新生血管形成。此外，Takagi等,研究显示：人视网膜血管增殖标本中，Ang-2，Tie-2表达均有升高；且在缺血性视网膜疾病所致的视网膜血管增殖膜中Ang-2、Tie-2表达明显高于非缺血性视网膜疾病，同时Ozaki等收集了30例PDR病例和21例增生性玻璃体视网膜病变患者玻璃体液，经过检测发现Ang水平均有所升高。

这些研究结果都提示Ang-2/Tie-2信号传导系统的各个成员对视网膜微血管形成起到重要的促进作用，而DR是糖尿病常见的微血管并发症，新生血管的形成是造成视力损害的重要因素，因此如何在DR的状况下调整Ang/Tie-2信号系统各成员的表达及作用，使其在DR早期血管稳定、防渗漏中最大程度的发挥有益作用，是一个值得深入研究的问题。目前关于 miRNAs对Ang/Tie-2信号系统的调控作用机制研究尚少，仅有研究表明miRNAs可以调节人脐静脉内皮细胞中Tie-2的表达，但是综合以往研究多表明 miRNAs对新生血管形成的潜在调控作用及Ang/Tie-2信号系统在 DR新生血管形成中发挥的重要作用，miRNAs也有可能通过调节视网膜微血管内皮细胞中 Ang/Tie-2信号系统从而调控DR视网膜新生血管的形成。

4. 小结

大家知道血管新生在生理和病理的条件下均可以产生，但不同的是：生理条件下的血管生成是一个有序的过程，而病理条件下的血管生成表现为无序和不可控制。血管生成是一个复杂的过程，有多种生长因子、细胞黏附分子、转录因子等参与其中，如：VEGF/VEGFR、TGF-β、Ang/Tie、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶、缺氧诱导因子等。在正常的血管代谢中这些正向、负向作用因子保持平衡，在高糖作用下，平衡被打破，VEGF等正向因子被激活，刺激新生血管的形成。其主要步骤是：① 在VEGF等因子作用下，血管基底膜松弛，内皮细胞增殖；② 内皮细胞在黏附分子作用下，以出芽的方式向外迁徙；③ 各种促血管因子和其受体结合，促使内皮细胞形成管腔；④ 在各种血管生成因子的作用下，促进内皮细胞和周围支持细胞相互作用，使血管壁紧密，完成血管的重塑。这个过程可以简单的概括为：增殖、出芽、形成、重塑4个阶段。在该过程中VEGF/VEGFR、Ang/Tie-2、TGF-β发挥着关键作用，而这些血管生成因子的主要作用靶细胞――内皮细胞的生物学行为和功能在新生血管的形成中也发挥着不可忽视的作用。因此，我们认为对作用于新生血管形成各个阶段的关键性因子—VEGF/VEGFR、TGF-β、Ang/Tie-2信号系统和血管内皮细胞的生物学功能进行调控有可能成为抑制DR新生血管形成的一种新方法。目前有研究[32]表明使用小分子干扰 RNA选择性抑制人脐静脉内皮细胞中的DICER酶的表达，从而阻断miRNAs的成熟过程，发现miRNAs的减少抑制了内皮细胞的增殖以及内皮条索的形成，并改变了多种影响内皮细胞生物学行为及血管生成能力的重要调节因子的表达情况，如 TEK/Tie-2、KDR/VEGFR等。因而随着对miRNAs功能的深入了解，许多学者推测miRNAs在眼部目前治疗糖尿病性视网膜病变新生血管形成的过程中有着不可估量的治疗前景。寻找能靶向调控血管形成的miRNAs，并探讨其内在调控途径，对深入和全面理解血管形成的分子机制有着重要的意义,并使得 miRNAs有可能成为抑制糖尿病性视网膜病变治疗的新靶点。

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R774.1

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1672-5018（2016）09-011-02