Box-Behnken设计优化美洲大蠊中游离氨基酸提取工艺＊

邹俊波，熊永爱，桑文涛，杨胜群

（成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室/四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地 成都 611137）

Box-Behnken设计优化美洲大蠊中游离氨基酸提取工艺＊

邹俊波＊＊，熊永爱，桑文涛，杨胜群

（成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室/四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地 成都 611137）

目的：采用响应面法优化美洲大蠊中氨基酸的提取工艺参数。方法：在单因素实验的基础上，利用Box-Behnken中心组合设计，以氨基酸含量、干膏率为评价指标，对提取时间、料液比、醇提浓度、提取次数等4个主要影响因素进行考察，并进行工艺优化。结果：通过Box-Behnken效应面法及总评归一值（Optical Density，OD）系统评价，确定最优提取工艺如下：取饮片适量，加入12倍量70%乙醇溶液，提取2次，每次120 min。利用该工艺条件得到的氨基酸含量及干膏率与理论预测值基本一致。结论：实验确立的响应面模型与实际情况拟合良好，能较好的预测美洲大蠊中氨基酸含量及干膏率等指标，该方法具有一定的实用价值。

游离氨基酸 Box-Behnken设计 总评归一值 美洲大蠊

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）属于昆虫纲蜚蠊目蜚蠊科，在地球上有3亿多年的生存历史，有“活化石”之称，是至今为止繁衍最成功的昆虫类群之一[1]。美洲大蠊的药用记载最早见于《神农本草经》，目前以其为原料已开发出数种中成药，如心脉隆注射液、康复新液、肝龙胶囊和消症益肝片等，在国内取得了较大的经济效益。

回流提取方法为工业最常见的提取方法之一，具有提取效率高，节约溶媒等优点。响应面法通过对等高线及响应曲面的客观分析寻求最佳参数，采用多元二次回归方程拟合响应值与因素之间函数关系的一种优化统计方法。目前，该法已在很多领域如化学、生物学、医药学等得到广泛应用。本研究采用Box-Behnken响应面法设计优选提取工艺，考察溶媒量、溶媒浓度、提取时间以及提取次数等对氨基酸含量和干膏率的影响，确定最佳提取方案，以期为美洲大蠊相关制剂的工业化提取提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

RE52CS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），BT25S型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司），MODEL型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），B-220型电热恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）， Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），色谱柱为Agilent XDB C-18（4.6×250 mm，5 μm）。

1.2 药材及对照品

美洲大蠊饮片购于成都荷花池中药材市场，经成都中医药大学马逾英教授鉴定为蜚蠊科大蠊属昆虫美洲大蠊Periplaneta americana L.；甘氨酸（批号：140622-1）、脯氨酸（批号：140721-7）、丙氨酸（批号：141109-6）、缬氨酸（批号：141214-5）、亮氨酸对照品（批号：142221-7）均购于成都曼思特生物科技有限公司。

表1 氨基酸分析系统二元梯度程序

1.3 试剂

乙腈（色谱纯，美国Tedia公司），其他试剂均为分析纯，水为自制超纯水。

2 实验方法

2.1 游离氨基酸提取工艺

拣选、粉碎美洲大蠊饮片，加10倍量（V）的85%乙醇溶液连续回流提取2次，每次2 h，减压回收乙醇，浓缩收膏，再加入20倍量（V）的纯化水，混合、搅拌充分，静置待药液分层，过滤，收集滤液，减压浓缩，即得。

2.2 氨基酸含量测定[2-6]

2.2.1 对照品溶液储备液制备

精密称取缬氨酸（Valine，VAL）、脯氨酸（Proline，PRO）、甘氨酸（Glycine，GLY）、丙氨酸（Alanine，ALA）、亮氨酸（Leucine，LEU）对照品适量，用硼酸缓冲溶液（pH=9.0）制成每1 mL含上述对照品分别为8、8、10、15、8 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液储备液制备

取“2.1”项下浓缩液2.0 mL，转移至25 mL量瓶中，加硼酸缓冲溶液（pH=9.0）稀释至刻度，摇匀，即得。

图1 游离氨基酸对照品、样品溶液、空白溶液的HPLC色谱图注：A.游离氨基酸对照品，B.样品溶液，C.空白溶液色谱图。

2.2.3 对照品、供试品溶液制备

取“2.2.1”及“2.2.2”项下溶液各5.0 mL，转移至10 mL棕色量瓶中，加入2,4-二硝基氟苯溶液2.0 mL，摇匀，封口，放在60℃水浴中，避光暗反应60 min。待反应完成后，冷却至室温，用磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）稀释至刻度，混匀，滤过，续滤液即为对照品溶液、供试品溶液，待测。

2.2.4 色谱条件

大连依利特Elite-AAK 氨基酸专用柱（4.6×250 mm，5 μm），流动相A：0.05 mol·L-1醋酸钠缓冲溶液，含1%（V）N，N-二甲基甲酰胺，pH=6.8；流动相B：乙腈-水（1:1）；流速：1.2 mL·min-1。检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。流动相洗脱梯度见表1。

此条件下，各对照品分离度及对称性较好，如图1所示。

2.2.5 线性关系考察

按“2.2.4”项下色谱条件，取游离氨基酸对照品溶液2、4、6、8、10、20 μL注入高效液相色谱仪。分别以各游离氨基酸峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行线性回归，各成分回归系数分别为0.999 2、0.999 6、0.999 7、0.999 1、0.999 9，结果表明：各游离氨基酸在相应线性范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.6 精密度

精密吸取氨基酸对照品溶液，连续进样6次，各游离氨基酸峰面积的RSD分别为1.83%、2.03%、1.19%、1.91%、2.01%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性

取供试品溶液，分别于0、1、2、4、24 h测定氨基酸含量，各成分峰面积RSD分别为1.69%、1.93%、1.97%、1.08%、1.83%，表明在方法稳定性良好。

2.2.8 重复性

分别制备供试品溶液6份，连续进样，得氨基酸平均含量的RSD分别为2.52%、1.89%、2.33%、2.07%、1.99%。表明该方法重复性良好。

2.2.9 准确性

精密量取9份已知含量的氨基酸浓缩液1.0 mL，按所含氨基酸含量的80%、100%、120%分别加入各氨基酸对照品储备液适量，平行制备3份，供试品溶液，测定，计算回收率，平均回收率分别为96.42%、94.83%、95.02%、96.99%、97.78%，RSD分别为2.92%、2.69%、3.89%、3.63%、3.46%，表明该方法准确性良好。

2.3 干膏率

精密量取氨基酸浓缩液适量，置恒重蒸发皿中，按《中国药典》2015 年版一部附录IXG干燥失重测定法测定，计算干膏率。

3 结果

3.1 单因素实验

3.1.1 提取时间对氨基酸含量的影响

精密称取美洲大蠊饮片100 g，固定料液比、醇提浓度和提取次数，考察不同提取时间30、60、90、120、150 min对氨基酸含量的影响。从图2A可知，氨基酸含量随提取时间的延长而逐渐升高，在90 min后趋于平稳。因此，在进一步通过Box-Behnken优化最佳提取工艺时，应在90 min的两端参数进行筛选，即选择60、90、120 min进行综合考察。

3.1.2 料液比对氨基酸含量的影响

准确称取美洲大蠊饮片100 g，固定提取时间、醇提浓度和提取次数，考察不同料液比1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16对氨基酸含量的影响。图2B表明，氨基酸含量随着料液比的增加而不断增加，当溶媒量超过10倍后，含量增加逐渐趋于平缓，在后续Box-Behnken设计中，溶媒量的考察范围应为10-14倍。

3.1.3 醇提浓度对氨基酸含量的影响

准确称取美洲大蠊饮片100 g，固定提取时间、料液比和提取次数，考察不同醇提浓度50%、60%、70%、80%、90%对氨基酸含量的影响。图2C表明，随着提取用醇提浓度的增加，氨基酸总量亦即增加，但在超过70%浓度后，游离氨基酸的含量开始下降，故在后续Box-Behnken优化时，考察范围设定为60%-80%。

3.1.4 提取次数对氨基酸含量的影响

准确称取美洲大蠊饮片100 g，固定提取时间、料液比和醇提浓度，考察不同提取次数1、2、3、4次对氨基酸含量的影响。从图2D可看出，提取次数的增加，氨基酸总含量也增加，但2次时已基本可提取完全，从提取效果和大生产效益角度综合考虑，最佳提取次数定为2次。

3.2 Box-Behnken效应面法优化试验

3.2.1 模型建立及显著性检验

单因素实验表明，提取2次能基本将氨基酸提取完全，因此，将提取次数定为2次，后续效应面实验不再对提取次数进行考察。实验拟选取提取时间（X1）、料液比（X2）和醇提浓度（X3）等作为影响因素，以氨基酸含量和干膏率“总评归一值”（OD）Y为评价指标，根据Hassan公式对各个指标进行均一化处理[2-6]。

计算公式:di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）

其中，Yi为实测值，Ymin和Yma系指每一指标在不同次实验中测得的所有值中的最小和最大值。

计算出各指标的di值后，OD = (d1×d2…×d k)1/k，k为指标数。实验设计和结果见表2、表3。

图2 美洲大蠊游离氨基酸提取的单因素实验结果

表2 氨基酸提取工艺Box-Behnke n实验设计的因素水平表

以归一值OD为因变量，通过Design Expert V8.0.5b 软件对各因素进行回归拟合，得到氨基酸含量和干膏率归一值（Y）对提取时间（X1）、料液比（X2）和醇提浓度（X3）的二项多次回归模型方程为

Y=0.80+0.10X1+0.031X2-0.076X3+0.07X1X2-0.13X1X3-2.5E-003X2X3+0.053X12-0.13X22-0.50X32

（R2=0.9607，R-Squared =0.882 2，P＜0.01，失拟度＞0.05）。

由拟合方程的相关系数R可以得知多元二项式拟合方程相关系数较高，拟合效果较好，模型方程显著（P＜0.01），模型失拟度P＞0.05，提示误差在可接受范围内，所建模型合理。R2=0.960 7，表明只有3.93%的差异是模型不适解释的，调整后R2（R2adj）值与预测R2（R2pred）值接近，表明该实验建立的模型合理可行。

3.2.2 效应面法分析及最优提取条件的确定

回归模型的响应曲面及等高线见图3。由图可知提取时间（X1）和醇提浓度（X3）交互作用显著，表现为响应曲面较陡，等高线图呈椭圆形。以OD值对最佳工艺进行预测，结果X1=119.09、X2=12.25、X3=68.93%。考虑到实验操作的可行性，各因素取整数值，最终确定最佳提取工艺为加入12倍量70%乙醇溶液，提取2次，每次120 min。

表3 美洲大蠊氨基酸提取工艺Box-Behnken实验结果

3.2.3 模型验证

使用最优工艺进行3次验证试验，分别测定。预测OD值为0.976 6，3次样品的OD值分别为0.956 5、0.961 3、0.972 5，偏差分别是 2.06%、1.57%、0.42%，实际数据与预测结果比较接近，提示该模型的合理性和准确性，也证明了所选工艺稳定可行。

4 讨论

美洲大蠊为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称蟑螂。其药用历史可追溯至东汉《神农本草经》，当中所记载的药名为“蜚蠊”[7]。其与澳洲大蠊、褐色大蠊同为常用的蜚蠊科动物药，也是目前的药用研究趋向，相关制剂在临床上可用于治疗消化性溃疡[8]、烧烫伤、褥疮[9]、肝炎肝纤维化[10，11]等，药效良好，具有极高的药用价值。

美洲大蠊中氨基酸含量较高，种类齐全，氨基酸作为合成各种具有重要功能分子的必需前体物，具有调节免疫、调节代谢等独特的功能[12]。杨芳等[13]研究表明，美洲大蠊必需氨基酸含量占氨基酸总量的35.75%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量比值为0.55，与WHO/FAO规定的40%和0.6相接近，配比合理，具有很高的营养价值和保健作用。目前有较多文献报道了美洲大蠊中氨基酸的提取方法，主要集中于不同提取方式的对比[14，15]，如回流提取、超声提取、索氏提取以及闪式提取（包括水提取、醇提取等）等方法在氨基酸提取程度上的差异考察，未有相关文献对目前工业上最常用的回流提取法进行参数优化，本试验以此为切入点，结合Box-Behnken法在中药提取工艺中的普遍应用及诸多优点[16-18]，进行美洲大蠊中游离氨基酸提取工艺的Box-Behnken设计优化。

图3 效应面分析提取时间、料液比、醇提浓度因素与响应值（OD）的等高图和三维图

本试验以美洲大蠊的有效成分氨基酸为指标，对回流提取工艺进行优化，提高了总氨基酸的提取率，相对优于超声及索氏提取工艺，与文献报道基本一致[19]，为工艺和后续成型及产品质量控制提供衔接和过程控制作用。在试验设计中，多指标的处理一般多数采用加权评分的综合评分法，依据评分高低优选条件，目前权重值的判断仍存在较大争议，对结果的客观性会造成一定的影响。通过引入总评“归一值”（OD），使所有指标均量化体现，客观地综合所有试验指标，使多指标模型具有更准确的拟合性和预测性。故本实验引入了总评“归一值”来考察不同提取工艺对氨基酸含量和干膏率的总评“归一值”（OD）的影响，以此确定最佳游离氨基酸提取工艺。试验结果表明该法所拟合的方程稳定可行，所优选的工艺对美洲大蠊的工业化生产具有一定的指导意义。

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Optimizing Extraction Process of Free Amino Acid in Periplaneta americana L. by Box-Behnken Design

Zou Junbo,Xiong Yongai,Sang Wentao,Yang Shengqun
(The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine / Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province / Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and MOST ,Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese MedicineKey Laboratory of Systematic Research,Chengdu 611137,China)

This study aimed to optimize the extraction process of free amino acid in Periplaneta americana L. by Box-Behnken design-response surface methodology. On the basis of single factor screening,a three-factorand three-level Box-Behnken experimental design was employed with extraction time (X1),solvent ratio (X2) and solvent concentration (X3) as independent variables. And extraction frequence was also involved in a major impact. Dependent variables were transformed into desirability mathematically by comprehensive evaluation method and Hassan's method. Data of overall desirability was fitted to a second order polynomial equation,through which three dimensional response surface graphs were produced. Optimum experimental conditions were selected from the stationary point of the response surfaces. Through the Box-Behnken design-response surface methodology and prognostic scoring system optimized scheme,the preferred processing conditions were as follows: added 12 times of 70% ethyl alcohol,extracted twice with each for 120 min. The content of amino acid and the dry extra yield actually extracted were in coordinence with the disrable values. In conclusion,the extraction technology of free amino acid optimized by Box-Behnken Design was practical and feasible with good fitting degree for predicting indexes (e.g. free amino acid and dry extra yield) in Periplaneta americana L..

Free amino acid,Periplaneta americana L.,Box-Behnken experimental design,overall desirability

10.11842/wst.2016.05.033

R286

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2015-10-14

修回日期：2015-12-26

＊ 四川省科技厅项目（2014TD0007）：中药药理四川省青年科技创新研究团队，负责人：曾南。

＊＊ 通讯作者：邹俊波，在读博士，主要研究方向：中药药效与毒理研究。