PCR-变性梯度凝胶电泳技术分析肺炎儿童下呼吸道菌群多样性

黄君华，武永红，张书婉

（1.西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021；2.西安市儿童医院检验科，陕西 西安 710003）

PCR-变性梯度凝胶电泳技术分析肺炎儿童下呼吸道菌群多样性

黄君华1，武永红1，张书婉2

（1.西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021；2.西安市儿童医院检验科，陕西 西安 710003）

目的 初步探讨PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)检测肺炎儿童下呼吸道菌群多样性的作用。方法收集10份培养阳性的患儿肺泡灌洗液2～5 mL，经细菌DNA提取、16S rDNA-PCR后进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，对优势条带进行测序。结果经培养10份标本中7份鉴定为一种菌感染，3份培养出两种病原菌；经PCR-DGGE分析8份标本出现多条明显条带，2份得到一条条带，共筛选出12个优势条带；DGGE法得到的细菌种类多于培养法。结论PCR-DGGE可较好地鉴定混合细菌感染性肺炎病原菌并能检测到培养法没有检出的细菌；儿童肺炎主要以肺炎链球菌、大肠埃希菌、草绿色链球菌等病原菌为主。

肺炎；变性梯度凝胶电泳；菌群多样性；儿童

肺炎是儿童常见的感染性疾病之一，也是我国婴幼儿死亡的首要原因[1]。其中多重细菌感染引起的肺炎数量日益增多，成为难治性肺炎和细菌耐药的主要原因[2]。目前国内外对肺炎的病原学诊断主要是痰培养，敏感度低，导致许多混合或潜在的病原菌无法检出。本文采用深部吸痰法采集患儿的下呼吸道标本，分别经培养和变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，探讨PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)检测混合细菌感染性肺炎的能力及感染状态下儿童下呼吸道的菌群多样性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 采用深部吸痰法从西安市儿童医院收集10份痰标本，每份标本2～5 mL。

1.2 方法

1.2.1 下呼吸道标本培养 用无菌棉拭子将标本均匀涂布于血平板上，经18～24 h培养，挑取可疑菌落用VITEK compact分析仪进行鉴定。

1.2.2 细菌总DNA提取 涂布平板后剩余痰标本经1 2000 rpm离心5 min，取沉淀，应用QIAamp Blood DNAMini Kit(QIAGEN，德国)，操作步骤按照说明书。

1.2.3 PCR扩增 选择16S rDNA-V3区进行扩增，引物序列参照Muyzer等[3]设计，扩增产物193 bp。50µL PCR扩增体系，包括：5µmol/L上下游引物各2µL，10×buffer 5µL，10 mmol/LdNTP1µL，2.5 mmol/L MgCl25µL，Taq酶(5 U/µL)0.4µL，DNA模板4µL，ddH2O 30.6µL。PCR反应采用touchdown PCR，参考文献[3]。

1.2.4 DGGE 采用Bio-Rad DcodeTMUniversal Mutation系统对PCR产物进行电泳。聚丙烯凝胶浓度8%，变性梯度范围30%～65%。具体步骤见文献[4]。

1.2.5 条带回收、克隆、测序 用无菌刀片切下优势条带放于Ep管，99℃金属浴20 min回收DNA，然后以管中液体为模板，用相同引物再次扩增。扩增产物送上海生工公司测序，登陆http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/Blast.cgi，将测序结果进行BLAST比对。

2 结 果

2.1 培养结果 经培养10份标本中7份鉴定为一种菌感染，3份培养出两种病原菌，具体结果见表1。

2.2 PCR-DGGE图谱 DGGE分析8例标本得到多条明显条带，2份仅有一条条带(图1)；10份肺炎共鉴定出12条优势条带，经测序比对细菌种类见表2。

表1 下呼吸道标本培养和DGGE分析结果

表2 DGGE回收细菌DNA片段比对结果及出现频率

图1 肺炎儿童下呼吸道标本DGGE图谱

3 讨 论

近年来，PCR-DGGE技术常被用于人体菌群微生态的分析，如肠道菌群[5]、皮肤菌群[6]、阑尾炎组织[7]等，可很好地检测出这些人体部位的优势菌群；并且在检测混合细菌感染方面也表现出良好的作用[4]。本研究应用该技术分析肺炎儿童的下呼吸道标本，既可以检测下呼吸道的混合感染病原菌，同时又可以分析肺炎状态下的菌群多样性，对病原学的快速诊断和难治性肺炎的耐药问题具有一定的提示作用，可谓“一举双得”。

正常情况下，人体的下呼吸道是无菌的，若有细菌侵入则可能造成感染。本研究在无菌条件下采用深部吸痰法[8]采集标本，保证了标本采集过程中不会被上呼吸道的正常菌群污染。混合细菌感染性肺炎是近年来比较常见的多发病，发生率较高[2]，临床表现严重，治疗效果较差[9]，细菌耐药情况严峻，由此形成的难治性肺炎的治疗常常棘手，早期快速的病原学诊断尤为重要。但目前多重病原菌感染性肺炎的研究多集中在成年人，尤其是老年患者，而针对儿童肺炎的混合细菌感染报道较少。本研究应用PCR-DGGE分析标本，从检测速度上要比传统的痰培养法提前1～2 d，从细菌检测的种类上可比培养法多检测出1～2种，可见该分子生物学方法较培养方法更快速更全面。

从实验结果可知，有3份标本培养法仅得到两种菌，而DGGE法得到三种菌(检出草绿色链球菌或干燥奈瑟菌)；有5份标本培养法仅得到一种菌，而DGGE法得到两种或三种菌，其中检出了副流感嗜血杆菌、溶血葡萄球菌、大肠埃希菌、卡他莫拉菌、洛菲不动杆菌等致病菌。可见儿童肺炎常由多种病原菌引起，但这种情况往往因培养方法的局限性或工作人员对菌落判断的主观性而没有被检出。此外，由结果可知儿童肺炎混合感染的病原菌主要是肺炎链球菌合并其他细菌感染，最常见的是肺炎链球菌+大肠埃希菌+草绿色链球菌。这与成年人肺炎的混合感染菌谱是不同，主要是肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌[2]。这种混合细菌的存在往往给治疗带来困难，主要是细菌耐药问题，本文A、C、F、I四个病例均对青霉素、头孢曲松、头孢噻肟耐药，但这几份样本仅培养出肺炎链球菌，是否混合状态导致了多重耐药尚需进一步研究。

综上所述，PCR-DGGE结合测序在检测多重细菌感染性肺炎时较培养方法快速全面，且对研究混合感染时的细菌耐药具有提示意义。

[1]谭文涛,笪欣.细菌培养和聚合酶链反应在肺炎患儿细菌病原学检测中的应用价值[J].中国实验诊断学,2015,19(1):98-100.

[2]蒋超英,韩丙超,李仕英.呼吸内科混合细菌感染调查分析[J].临床肺科杂志,2013,18(10):1774-1776.

[3]Muyzer G,de Waal EC,Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA [J].Appl Environ Microbiol,1993,59(3):695-700.

[4]黄君华,张书婉,张宁.PCR-DGGE结合测序在检测混合细菌感染中的价值[J].海南医学,2014,25(8):1154-1156.

[5]Wu X,Ma C,Han L,et al.Molecular characterisation of the faecal microbiota in patients with type 2 diabetes[J].Curr Microbiol,2010, 61(1):69-78.

[6]Li W,Han L,Yu P,et al.Nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis analysis of human skin microbial diversity with age[J].Microbiol Res,2014,169(9-10):686-692.

[7]杨静丽,余加林,王政力,等.16SrDNA变性梯度凝胶电泳技术与临床培养方法对比分析儿童阑尾炎组织菌群多样性[J].中国循证儿科杂志,2014,9(1):23-27.

[8]Lu W,Yu J,Ai Q,et al.Increased constituent ratios of Klebsiella sp, Acinetobacter sp,and Streptococcus sp,and a decrease in microflora diversity may be indicators of ventilator-associated pneumonia:a prospective study in the respiratory tracts of neonates[J].PLoS One, 2014,9(2):e87504.

[9]李子玉,李俊华,赵爱华.混合细菌感染性肺炎46例临床分析[J].河南医药信息,2000,8(4):3-4.

PCR-denaturing gradient gel electrophoresis analysis of lower respiratory tract microbial diversity in children with pneumonia.

HUANG Jun-hua1,WU Yong-hong1,ZHANG Shu-wan2.1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo explore the value of PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE) in analysis of lower respiratory tract microbial diversity in children with pneumonia.MethodsA total of 10 bronchoalveolar lavage fluid samples which has been identified bacterial infection by culture were included.The bacterial DNA was extracted,and 16S rDNA-V3 was amplified,following by DGGE,sequencing the predominant bonds and BLAST.ResultsIn the 10 samples,there was one bacterium in 7 samples,two bacteria in 3 samples by bacterial culture.There were multiple bonds in 8 samples by DGGE,and a total of 12 predominant bonds were identified.DGGE method can detect more bacterial species than bacterial culture method.ConclusionPCR-DGGE can identify mixed bacteria which caused pneumonia and detect the pathogen that cannot be detected by bacterial culture.The pneumonia in children is mainly caused by Streptococcus pneumoniae,Escherichia coli,Streptococcus viridans.

Pneumonia;DGGE;Microbial diversity;Children

R725.6

A

1003—6350（2016）10—1585—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.012

2016-01-14)

西安医学院青年科研基金项目（编号：2015QN09）

黄君华。E-mail：huangjunhua1985@163.com