MMP-2、MMP-9在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其临床意义

王碧玉，黄燕妮，羊文芳

(1.海南省农垦三亚医院检验科，海南 三亚 572000；2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南 海口 570102；3.儋州市第一人民医院检验科，海南 儋州 571700)

MMP-2、MMP-9在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其临床意义

王碧玉1，黄燕妮2，羊文芳3

(1.海南省农垦三亚医院检验科，海南 三亚 572000；2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南 海口 570102；3.儋州市第一人民医院检验科，海南 儋州 571700)

目的 观察膀胱移行细胞癌组织中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达情况，并探讨其表达的临床意义。方法选取海南省农垦三亚医院2012年1月至2015年1月收治的30例膀胱移行细胞癌组织标本作为观察组，另选取非膀胱肿瘤手术中切术的正常膀胱组织标本30例作为对照组，对所有标本黏膜中MMP-2、MMP-9的表达情况与表达强度通过免疫组化SP法联合高清晰度彩色医学图文分析系统进行检测，分析其表达的临床意义。结果观察组标本中的MMP-2、MMP-9的表达比对照组标本的表达明显增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，且MMP-2、MMP-9在正常膀胱上皮呈阴性表达；观察组标本中的MMP-2、MMP-9呈现高表达状态，且表达强度随着疾病分期、分级的增高而逐渐增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论在膀胱癌侵袭转移过程中，存在MMP-2、MMP-9的参与，在膀胱移行细胞癌中MMP-2、MMP-9的表达对其预后判断具有非常重要的参考价值。

膀胱移行细胞癌；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶9；表达

恶性肿瘤侵袭与转移是恶性肿瘤主要的生物学特征之一，其由多步骤、多因素参与，过程极其复杂[1]。在肿瘤的浸润与转移过程中，细胞外基质具有非常重要的作用，其中肿瘤浸润与转移的前提是基底膜或细胞外基质的降解。原发肿瘤细胞通过激活细胞合成并分泌各种降解酶类，使基底膜或细胞外基质发生降解，进入到循环系统，然后对免疫系统的攻击进行躲避，穿过脉管于继发部位发生外渗，进而转移灶得以形成。基质金属蛋白酶(Matrix metallo-proteinases，MMPs)通过使细胞外基质发生降解，加快癌细胞浸润周围组织的速度，是使细胞外基质各种成分发生降解的关键酶[2-4]。其中MMP-2与MMP-9是两种水解蛋白酶，主要参与细胞外基质与基底膜降解，在恶性肿瘤细胞的侵袭与转移过程中起到关键性作用。本研究通过应用免疫组织化学方法对膀胱移行细胞癌中MMP-2与MMP-9的表达进行检测，以探讨两者表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取海南省农垦三亚医院2012年1月至2015年1月外科收治的30例行膀胱癌手术切除的组织标本作为观察组，观察组中男性24例，女性6例，年龄36～76岁，平均(52.3±6.7)岁；所有膀胱癌均为膀胱移行细胞癌，且术前都接受过不同方式的抗癌治疗。将膀胱癌组织进行病理分级：其中10例为G1级，12例为G2级，8例为G3级。将膀胱癌组织进行TNM国际分期：其中12例为膀胱移行细胞癌Ⅰ期，10例为膀胱移行细胞癌Ⅱ期，8例为膀胱移行细胞癌Ⅲ期。另选取非膀胱肿瘤手术中切术的正常膀胱组织标本30例(均取自因良性前列腺增生症行开放手术的患者)作为对照组，对照组中男性22例，女性8例。

1.2 方法

1.2.1 实验材料 包括鼠抗人MMP-2单克隆抗体、MMP-9多克隆抗体，均采购自上海研生生化试剂有限公司；通用型SP二抗试剂盒及DAB显色试剂盒均采购自上海鲁汶生物科技有限公司。

1.2.2 实验方法 标本固定采用40 g/L甲醛，固定后进行包埋，用石蜡包埋，然后进行切片，切片厚度为2 μm，于载玻片上进行安置。标本进行常规脱蜡至水洗，组织切片进行水化，用枸橼酸钠缓冲液进行抗原修复。为阻断内源性过氧化物酶的活性，用3%过氧化氢去离子水进行孵育，时间30 min；山羊血清室温下进行孵育，时间30 min；采用胰蛋白酶对MMP-2与MMP-9进行消化；采用微波对抗原进行热修复；经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后滴加50 μl一抗于4℃冰箱过夜，进行3次PBS洗涤，2 min/次。滴加二抗，用通用型SP试剂盒中生物素进行标记，孵育30 min，温度为37℃，进行3次PBS洗涤，2 min/次；滴加50 μl链霉亲和素-辣根过氧化物酶，置于37℃孵育30 min，PBS洗涤3次，一次2 min；用DAB进行显色，温度为室温，DAB显色用PBS进行终止；用清水冲洗10 min，进行复染，然后脱水、透明、封片与照相。阳性对照采用已知为阳性的乳腺癌病理切片的一抗染色，阴性对照用PBS代替一抗。MMP-2与MMP-9表达的阳性染色面积及阳性染色的强度采用HMIAS-2000型全自动彩色图像分析系统进行分析，并用计算机计算积分光度与平均灰度。棕黄色或棕褐色是定位于细胞质的阳性着色。

1.3 统计学方法 MMP-2与MMP-9的相对含量以平均光密度值表示，计量数据以均数±标准差(±s)表示，均采用SPSS12.0统计学软件包进行独立样本t检验，并进行Spearman等相关分析和直线相关分析，检验水准为α=0.05，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 膀胱移行细胞癌与正常膀胱组织中MMP-2与MMP-9的表达 在所有膀胱移行细胞癌组织中，MMP-2与MMP-9在肿瘤细胞与间质细胞均有不同程度的表达，其中主要表达为肿瘤细胞，表达较低者为间质细胞。观察组中肿瘤细胞的胞浆内是MMP-2与MMP-9两者表达的主要部位，呈颗粒状，颜色为黄色至棕黄色，见图1，图2。本研究中MMP-2与MMP-9在所有正常膀胱组织中的表达均呈阴性。

图1 MMP-2在膀胱癌中的表达

图2 MMP-9在膀胱癌中的表达

2.2 膀胱移行细胞癌与正常膀胱组织中MMP-2与MMP-9平均光密度值比较 观察组MMP-2平均光密度值为(0.257±0.031)，对照组为(0.201±0.020)，与对照组比较，观察组MMP-2平均光密度值明显提高，差异有统计学意义(t=6.311，P＜0.05)；观察组 MMP-9平均光密度值为(0.248± 0.023)，对照组为(0.209±0.022)，与对照组比较，观察组MMP-9平均光密度值明显提高，差异有统计学意义(t=4.813，P＜0.05)。

2.3 不同分级膀胱移行细胞癌中MMP-2与MMP-9平均光密度值比较 随着膀胱癌分级的增加，MMP-2与MMP-9在膀胱移行细胞癌组织中的表达增加，MMP-2与MMP-9的平均光密度值呈递增趋势。Spearman等级相关分析结果显示，MMP-2与MMP-9平均光密度值都与膀胱癌分级呈正相关，相关系数分别为0.86，0.77，0.69(P均＜0.05)，见表1。

表1 不同分级膀胱移行细胞癌中MMP-2与MMP-9平均光密度值比较(±s)

表1 不同分级膀胱移行细胞癌中MMP-2与MMP-9平均光密度值比较(±s)

注：与G1级比较，aP＜0.05；与G2级比较，bP＜0.05。

组别 例数MMP-2MMP-9 G1级G2级G3级10 12 8 0.229±0.021 0.246±0.024ab0.285±0.037ab0.222±0.023 0.235±0.025ab0.273±0.036ab

2.4 不同分期膀胱移行细胞癌中MMP-2与MMP-9平均光密度值比较 随着膀胱肿瘤分期的增高，MMP-2与MMP-9在膀胱移行细胞癌组织中的表达增加，MMP-2与MMP-9的平均光密度值呈递增趋势。Spearman等级相关分析结果显示，MMP-2与MMP-9平均光密度值都与膀胱癌分期呈正相关，相关系数分别为0.747，0.648，0.603(P均＜0.05)，见表2。

表2 不同分期膀胱移行细胞癌中MMP-2与MMP-9平均光密度值比较(±s)

表2 不同分期膀胱移行细胞癌中MMP-2与MMP-9平均光密度值比较(±s)

注：与Ⅰ期比较，aP＜0.05；与Ⅱ期比较，bP＜0.05。

组别Ⅰ组Ⅱ期Ⅲ期例数12 10 8 MMP-2 0.226±0.020 0.243±0.023ab0.280±0.033abMMP-9 0.221±0.023 0.240±0.026ab0.281±0.031ab

2.5 膀胱移行细胞癌中MMP-2与MMP-9表达的相关性 经直线相关分析可知，MMP-2平均光密度值与MMP-9平均光密度值呈正相关(r=0.495，P＜0.05)。

3 讨 论

临床泌尿系统中，膀胱癌是最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率均占泌尿疾病首位，对膀胱癌进行早期诊断对治疗与改善患者生存质量具有非常重要的作用。对膀胱癌进行早期诊断的常用方法包括尿脱落细胞学检查及膀胱镜检查，但这些检查方式均存在局限性，在膀胱癌早期诊断中，都无法成为的最理想的方法。近年来，关于有助于早期诊断膀胱癌的高度特异的生物学指标依然没有找到。

MMPs是一组高度同源的参与基底膜与细胞外基质降解的蛋白酶类，到目前为止，已经发现了20余种，这些酶都具有相似的分子结构。构成MMPs超家族的MMPs各成员均具有特异的底物。MMPs种类繁多，但是具有以下几种共性：(1)氨基酸序列及蛋白质结构具有相似性；(2)均可被其特异组织抑制因子TIMPs所抑制；(3)能够同时降解多种细胞外基质成分；(4)都是以酶的形式被分泌出来。MMPs以什么种类、什么形式为主进行表达，主要与肿瘤的种类及恶性程度存在密切的关系。MMPs的功能主要包括：(1)对细胞粘着进行调节；(2)对细胞外基质末的有效成分进行降解；(3)作用于其他蛋白或者细胞外组分，进而启动潜在的生物学功能；(4)参与胚胎发育的过程。有研究结果发现，在正常组织中，MMPs没有表达，或仅有较弱水平的表达，与良性肿瘤及正常组织相比，MMPs在恶性肿瘤细胞中的表达明显提高[5-6]。临床上认为，MMP-2(明胶酶A)与MMP-9(明胶酶B)是与肿瘤浸润与转移关系最为密切的MMPs家族[7]。MMP-2与MMP-9都是以酶原的形式进行合成，两种酶的激活主要发生在分泌出细胞的过程中，MMP-2与MMP-9的作用底物包括Ⅳ型胶原等各种成分，对靠近肿瘤表面的细胞外基质中的Ⅳ型胶原与明胶具有降解、破坏的作用，同时沿着缺失的基底膜，肿瘤细胞会浸润周围的组织，引发肿瘤的侵袭与转移发生。另有研究发现，在血管的形成过程中，MMP-2与MMP-9发挥着非常重要的作用[8]。在MMP-2基因缺失的小鼠体内，血管的形成与肿瘤的生长会显著性降低。MMP-9不仅能够使VEGF的释放得以促进，进而参与肿瘤血管的形成，并且能够使成熟血管结构的形成得到促进，同时促进肿瘤的生长[9-10]。

本研究结果显示，MMP-2与MMP-9在正常膀胱黏膜组织中呈阴性表达或表达较弱，这就表明MMP-2与MMP-9在正常膀胱组织中基本无酶活性。与正常膀胱组织比较，MMP-2与MMP-9在膀胱移行细胞癌中的表达明显增强，这就表明，MMP-2与MMP-9的表达水平在膀胱癌的早期诊断中其重要的作用。本研究还显示，与正常间质相比，MMP-2与MMP-9在肿瘤间质中的表达强度提高，且分布不均匀。这就表明肿瘤细胞产生的MMP-2与MMP-9蛋白随着肿瘤的生长而越来愈多，使其穿透能力逐步增强，进而使肿瘤的转移明显加速[11]。本研究还发现，随着膀胱癌分级与分期的增加，MMP-2与MMP-9在膀胱移行细胞癌组织中的表达增加，MMP-2与MMP-9的平均光密度值呈递增趋势。MMP-2与MMP-9平均光密度值都与膀胱癌分级、分期呈正相关，与研究结果较为一致[12-15]，这就表明在膀胱移行细胞癌分化过程中，癌组织中的MMP-9表达程度较高，尤其是浸润肌层的癌组织中的MMP-9明显高于局限在黏膜内的癌组织[16]。因此，本研究认为，MMP-2与MMP-9可以作为膀胱移行细胞癌早期诊断及患者预后的有效标志物。

综上所述，在膀胱癌侵袭转移过程中有MMP-2、MMP-9的参与，在膀胱移行细胞癌中MMP-2、MMP-9的表法对其预后判断具有非常重要的参考价值。

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Expression of MMP-2,MMP-9 in human transitional cell carcinoma of bladder and their clinical significance.

WANG Bi-yu1,HUANG Yan-ni2,YANG Wen-fang2.1.Department of Clinical Laboratory,Hainan Provincial Nongken Sanya Hospital,Sanya 572000,Hainan,CHINA;2.College of Tropical Medicine and Laboratory Medicine,Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA;3.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Danzhou, Danzhou 571700,Hainan,CHINA

Objective To observe the expression of matrix metalloproteinases 2(MMP-2)and matrix metalloproteinase 9(MMP-9)in human transitional cell carcinoma of bladder and discuss the clinical significance.MethodsThirty tissue samples of transitional cell carcinoma of bladder were collected in Hainan Provincial Nongken Sanya Hospital from Jan.2012 to Jan.2015(the observation group).Another 30 cases of normal bladder tissues were selected as the control group.Immunohistochemical SP method and high-definition color medical graphic analysis system were used to detect the expression of MMP-2 and MMP-9.The clinical significance of the expression was analyzed.ResultsThe expression of MMP-2 and MMP-9 in the observation group was significantly higher than that in the control group(P＜0.05),and the expression of MMP-2 and MMP-9 in normal bladder epithelium were negative.In the observation group, MMP-2 and MMP-9 presents a high expression,and the expression strength increased gradually with the increase of the grade and stage of disease(P＜0.05).ConclusionMMP-2 and MMP-9 participate the process of invasion and metastasis of bladder cancer,and the expression of MMP-2 and MMP-9 in transitional cell carcinoma of bladder of provides important reference for the evaluation of the prognosis.

Transitional cell carcinoma of bladder;Matrix metalloproteinases 2(MMP-2);Matrix metalloproteinases 9(MMP-9);Expression

R737.14

A

1003—6350（2016）06—0877—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.06.006

2015-09-27)

黄燕妮。E-mail：6163162@qq.com