桑菊饮抗菌及对小鼠免疫功能影响的初步研究

苏治福　张钲应　万泽房　熊文林　杜昕如　雷昕　俞琦

【摘 要】 目的：观察桑菊饮的抗菌作用和对小鼠免疫功能的影响，探讨其治疗上呼吸道感染等病症的机制。方法：采用体外抗菌试验检测桑菊饮对不同细菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；将小鼠随机分为生理盐水对照组、桑菊饮高/低剂量组，以生理盐水和不同剂量桑菊饮连续灌胃7d，检测各组小鼠免疫器官指数、脾淋巴细胞增殖能力和腹腔巨噬细胞吞噬能力。结果：桑菊饮对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌作用最强，MIC、MBC均为50mg/ml和100mg/ml。与生理盐水对照组比较，桑菊饮能显著提高小鼠胸腺、脾脏指数，增强淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞的吞噬功能（P<0.05）。结论：桑菊饮具有抗菌和增强机体免疫功能的活性，该活性是防治上呼吸道感染等症的作用之一。

【关键词】 桑菊饮；抗菌；免疫功能

【中图分类号】R258.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0016-02

桑菊饮出自清代《温病条辨》，由桑叶、菊花、连翘、苦桔梗等八味中药组成，为辛凉解表之剂，具有宣肺止咳、疏风清热的功效，临床用于外感风热、咳嗽初起之证，如上呼吸道感染、急性气管炎等均可加减运用。临床研究表明，桑菊饮对上呼吸道感染、咳嗽、支气管炎等病症具有显著疗效[1-4]，但对其作用机制的研究报道较少。本研究拟通过桑菊饮的抗菌试验和对小鼠免疫器官指数、脾淋巴细胞功能和吞噬细胞吞噬能力的检测，探讨该方药防治上呼吸道感染的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 药材 桑叶、菊花、薄荷、苦桔梗、杏仁、连翘、苇根、生甘草均购自同仁堂贵阳药店，经鉴定为正品。按常规方法用水提取、浓缩，调整浓度为0.8g生药/ml，滤过除菌后置4℃冰箱备用。

1.2 试剂 营养肉汤培养基（批号：131010）、营养琼脂培养基（批号：130731）购自杭州天和微生物试剂有限公司；S.S琼脂培养基（批号：120725，北京陆桥技术有限责任公司）；RPMI1640培养基、胎牛血清（美国GIBCO公司）；刀豆蛋白A（美国Sigma公司）；MTT（美国Amkesco公司）。

1.3 仪器 AB135-S型电子天平（梅特勒托利多上海公司）；3131型CO2培养箱（美国Thermo公司）；DG3021酶联免疫检测仪（美国BIO-TEK公司）；生物显微镜（日本Nikon公司）。

1.4 菌种 金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、肺炎链球菌（ATCC49619）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.5 实验动物 SPF级昆明种小鼠24只，体重（20±2）g，雌雄各半，购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，动物合格证：SCXK（军）2012-0011。

2 方法

2.1 体外抗菌试验

2.1.1 菌液的制备[5] 采取十倍稀释法，肺炎链球菌以10% 胎牛血清营养肉汤培养基37℃培养18 h，以相同培养基1∶[KG-*3/5]10稀释为试验菌液；其他细菌以营养肉汤培养基增菌培养后，制成1×103细菌悬液。

2.1.2 最低抑菌浓度（MIC）测定 采用二倍稀释法，用相应液体培养基稀释药物，共8个药物浓度，分别为800、400、200、100、50、25、12.5、6.25mg/ml，依次加入24孔细胞培养板，1ml/每孔，各孔加入试验菌液50 μl，并设菌液和培养基对照孔，37℃培养18 h，肉眼和倒置显微镜下观察有无细菌生长。以能抑制细菌生长的药物最高稀释度为最低抑菌浓度（MIC）。

2.1.3 最低杀菌浓度（MBC）测定[6] 分别取上述无细菌生长孔内的培养物100 μl接种于相应固体琼脂平板培养基上，37℃培养24 h，观察结果。以菌落数少于5个的药物最高稀释度为该药的最小杀菌浓度（MBC）。

2.2 对小鼠免疫功能的影响

2.2.1 动物分组及给药 小鼠购回适应性喂养3 d后，随机分为生理盐水对照组、桑菊饮高剂量组、桑菊饮低剂量组，每组8只。高、低剂量组分别按10 g/kg 和5 g/kg（体重）灌胃，每天2次，连续7d。生理盐水对照组代以等体积生理盐水。

2.2.2 免疫器官指数测定 末次给药5 h后，脱颈椎处死小鼠，称量小鼠体重，取腹腔液后，无菌分离小鼠的胸腺和脾脏，于电子天平上称重。免疫器官系数=免疫器官重量∕体重。

2.2.3 脾淋巴细胞的制备 将分离的脾脏置于200目的筛网研磨，收集细胞悬液，4℃，600r离心8 min，弃上清。用Hank's液重悬细胞，加5 ml红细胞裂解液作用5 min，再用Hank's液离心洗涤2次，用RPMI-1640培养液重悬细胞，台盼蓝染色，镜下计数，调整细胞浓度为3×106个/ml。

2.2.4 MTT法测定淋巴细胞增殖能力[7] 取脾细胞悬液加入到24孔培养板中，每孔1 ml，加入ConA液75 μl（同时设不加ConA的对照孔），置37℃，5% CO2，相对湿度为100%的CO2培养箱中培养68 h，每孔加入MTT 50 μl，继续培养4 h，培养结束后，加入酸性异丙醇，充分混匀，用酶标仪于波长570nm处测光密度值（OD）。

2.2.5 中性红法检测巨噬细胞吞噬功能[8] 常规方法无菌取腹腔液，调整细胞浓度至5×106个/ml。将细胞置于96孔培养板培养24h后，弃上清，加入含培养液的浓度为0.002 g /ml中性红溶液200μl/孔，置37℃，5% CO2培养3 h，离心弃上清，PBS 洗2次，除去细胞外未被吞噬的中性红，最后加细胞裂解液（乙酸∶[KG-*3/5]乙醇=1∶[KG-*3/5]1）200μl，待细胞全部裂解后，用全自动酶标仪在 520 nm测OD值。

2.3 统计分析 应用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x[TX-*3]±s）表示，采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 体外抗菌作用 由表1可知，桑菊饮对受试的5个菌种均有明显的抑制作用。其中，对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌作用最强，MIC、MBC分别为50mg/ml、100mg/ml。

3.2 对小鼠免疫器官指数的影响 由表2可知，与生理盐水对照组比较，桑菊饮高剂量组胸腺、脾脏指数均明显升高，低剂量组能显著提高脾脏指数（P<0.01）。

3.3 对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞功能的影响 由表3可知，与生理盐水对照组比较，桑菊饮高、低剂量组小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力和腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力均显著提高（P<0.05）。

4 讨论

上呼吸道感染属于中医外感疾病范畴，与“感冒”、“伤风”、“伤寒”、“冒暑”、“伤风发热”等多种中医病证有关[9]，主要由病毒、细菌等微生物入侵引起上呼吸道炎症，表现为头痛、咳嗽、流涕、咽痛等局部症状及发热、乏力等全身症状。西医治疗以对症治疗和支持治疗为主，尚无特效药。大量临床研究表明，中医药防治上呼吸道感染具有疗效好、副反应小、不易耐药等特点，临床应用越来越广泛。桑菊饮为辛凉解表剂，具有宣肺止咳、疏风清热的功效。药理研究表明，方中的桑叶、菊花、连翘等具有明显抗菌作用；杏仁、苦桔梗、生甘草具有抗炎止咳等功效。但对其组成方药后的药理作用研究很少，为探索该方药防治上呼吸道感染的作用机制，我们对桑菊饮的抗菌作用和对小鼠免疫功能的影响进行了初步研究。

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌是上呼吸道感染常见的病原体，可经外源性或内源性感染途径进入呼吸道，并大量繁殖产生毒力。研究结果显示，桑菊饮对以上菌种均有抑制作用，尤其是对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌作用最强，表明桑菊饮能通过抑制细菌生长而减轻感染症状。胸腺是中枢免疫器官，脾脏是最大的外周免疫器官，其重量可在一定程度上反映机体的免疫功能；脾脏T淋巴细胞是介导特异性细胞免疫的主要细胞，巨噬细胞参与了非特异性免疫和特异性免疫，在其中发挥重要的吞噬效应和抗原提呈作用。研究结果显示，与生理盐水对照组比较，桑菊饮能显著提高小鼠胸腺、脾脏指数，增强淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞的吞噬功能（P<0.05），高剂量组作用最明显。提示桑菊饮对机体的免疫功能具有调节作用，其可通过增强免疫器官功能、加强特异性和非特异性免疫反应，从而达到抗菌、抗感染的治疗效果，其作用具有一定的量效关系。提示桑菊饮临床防治上呼吸道感染的机制可能与其抗菌作用和增强机体的免疫力有关。

参考文献

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（收稿日期：2015.10.20）