高盐饮食对更年期焦虑症小鼠γ-氨基丁酸A受体mRNA表达的影响

陈晓阳　秦莉花　叶丽芝　黄　宽　李　晟

(湖南中医药大学护理学院,湖南　长沙　410208)



高盐饮食对更年期焦虑症小鼠γ-氨基丁酸A受体mRNA表达的影响

陈晓阳1，2,3秦莉花叶丽芝1，2黄宽1，2李晟1，2,3

(湖南中医药大学护理学院,湖南长沙410208)

〔摘要〕目的探讨高盐饮食对更年期焦虑症小鼠γ-氨基丁酸A受体(GABAAR)mRNA表达的影响。方法将大鼠随机分为空白组、模型组、4%高盐饮食组、8%高盐饮食组。其中4%高盐饮食组、8%高盐饮食组经高盐饮食干预1个月后，检测行为学及海马GABAAR mRNA表达情况。结果与模型组的开放臂进入次数(OE)+封闭臂进入次数(CE)、OE%、开放臂时间(OT)%比较，4%高盐饮食组、8%高盐饮食组均有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组、4%高盐饮食组、8%高盐饮食组GABAAR mRNA表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，4%高盐饮食组、8%高盐饮食组GABAAR mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论高盐饮食可能通过影响神经递质GABA受体的表达加重更年期焦虑症。

〔关键词〕高盐饮食；更年期焦虑症；γ-氨基丁酸A受体mRNA

1中药现代化教育厅重点实验室

2国家中医药管理局药性与药效研究三级实验室

3湖南中医药大学药学院

第一作者：陈晓阳(1953-)，女，教授，硕士，硕士生导师，主要从事中药药性理论基础与应用的研究。

更年期焦虑症已影响患者的健康、社会关系、家庭生活等方面，还可引起其他精神障碍疾病，甚至产生自杀行为。更年期焦虑症发生的病因病机尚未完全明确。随着年龄增长，人们味觉功能下降，在日常生活中表现为对食物口味改变，尤其要求食物中咸味重，而食盐量的超标会导致一系列的疾病，目前主要集中在高血压、骨质疏松等方面。前期实验已证明高盐饮食加重更年期焦虑症，与细胞内外的Na+、Cl-水平改变有关〔1〕。本课题运用分子生物学技术研究高盐对更年期焦虑症GABAAR mRNA表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物选用11月龄的昆明雌性小鼠，清洁级，体重35～45 g，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部代购，动物合格证号：scxk(湘)2009-0012。将小鼠置于动物实验室，室温控制在(20±2)℃之间，湿度50%～70%。小鼠分笼饲养，每笼 5只。在同一条件下，用颗粒型普通饲料喂养，饮用自来水，适应性喂养1 w 。

1.2试剂琼脂糖(西班牙)，逆转录试剂盒(Fermentas)，EDTA 、Tris、DEPC、E.B.(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，Taq酶(Genstar)，引物(上海生工)，DL2000 DNA Marker、dNTP(Genstar)，SYBGREEN PCR Mix Mix(ABI)。其他常规化学试剂购自北京化学试剂公司。

1.3主要仪器①行为学检测仪器：高架十字迷宫模型(EPM)，参照文献〔2〕自制，由两个相对的开放臂(35 cm×5 cm)、两个相对的封闭臂(35 cm×5 cm×5 cm)、一个连接四只臂的中央平台(5 cm×5 cm)组成。迷宫离地面50 cm，迷宫为木质结构，漆成黑色，2个开放臂同封闭臂呈相反方向，即开放臂-中央

平台-开放臂或封闭臂-中央平台-封闭臂，此二者互相垂直成为“+”形状。由木板制成。②其他主要仪器：荧光定量RCP仪、荧光PCR板(Thermo)，恒温水浴箱(J-MAX)，旋涡混合器(其林贝尔)，电泳仪、水平琼脂糖电泳槽(北京六一)，-80℃冰箱(中科美菱)。

1.4实验方法

1.4.1分组取11月龄左右雌性小鼠，按文献〔3〕方法连续5 d进行阴道涂片检查，呈现不规则动情周期的小鼠为自然更年期小鼠。按随机原则，将40只11月龄更年期小鼠随机分为4组，即空白组、模型组、 4%高盐饮食组、8%高盐饮食组。分组后空白组和模型组小鼠继续给予普通饲料，4%高盐饮食组小鼠予含4%氯化钠(NaCl)高盐颗粒饲料，8%高盐饮食组小鼠予含8%的NaCl高盐颗粒饲料喂养，自由摄食，自由饮用自来水，连续1个月。

1.4.2观察指标及方法

1.4.2.1高架十字迷宫实验小鼠EPM实验：迷宫测试前将每只小鼠放入一个50 cm×50 cm×30 cm塑料盒中，任其自由探究5 min 后迅速置于高架十字迷宫(EPM)的中央平台处，使其头部正对其中 一个开放臂，释放后即开始记录下述指标：开放臂进入次数(OE)：进入到任一开放臂的次数，以小鼠4个爪子均进入到臂内为准，中途1个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成；开放臂时间(OT)：进入开放臂的时间(s)；封闭臂进入次数(CE)：进入到任一封闭臂的次数，以小鼠4个爪子均进入到臂内为准；封闭臂时间(CT)：进入封闭臂的时间(s)；实验结束后分别计算出：①开放臂和封闭臂的总进入次数，即OE+CE，表示小鼠的运动活力；②开放臂进入次数比例(OE%)，即〔OE/(OE+CE)〕×100%；③开放臂时间比例(OT%)，即〔OT/(OT+CT)〕×100%。每只小鼠测试5 min，其间用10%乙醇溶液擦拭迷宫清除动物遗迹，并用干布擦净后再进行下1只小鼠的测试。

1.4.2.2荧光PCR实验结束后，快速断头处死小鼠，迅速在冰盘上剪开颅盖和脑膜，分离海马，用于提取组织总RNA。①总RNA提取按Trizol法的操作规程提取组织总RNA后纯化、反转录。PCR反应：20 μl反应体系。操作步骤及条件：总RNA 1 μl(约3 μg)，1 μl自由引物，10 μl无菌DEPC处理水，70℃加热5 min，迅速插入冰中冷却。再依次加入：4 μl 5×反应缓冲液，2 μl dNTP，1 μl RNase抑制剂，37℃加热5 min。再加入：1 μl M-MLV逆转录酶(200 U)，42℃，1 h 30 min；72℃反应10 min。所得cDNA于-20℃冻存。②引物设计及合成GABAAR正义链：5′-CATGAGGTTGACCGTGAGA-3′；GABAAR-反义链：5′-CTACAACCACTGAACGGGCT-3′；β-actin-正义链：5′CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′；β-actin反义链：5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。以上引物均由上海生工有限公司提供。③检测每个样本每个指标3个孔，共30 μl体系，每孔10 μl。体系组成：1 μl Template(反转录产物)，0.5 μl引物A(10 μmol/L)，0.5 μl引物B(10 μmol/L)，13 μl PCR H2O。定量PCR扩增程序：50℃2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，检测荧光，共40个循环。RT-PCR实验结果采用2-ΔCt法，计算目的基因mRNA转录水平的差异。

1.5统计学方法采用SPSS16.0软件采用单因素方差分析及Tamhan分析。

2结果

2.1高盐饮食对更年期焦虑症小鼠十字迷宫实验的影响由表1可知，与模型组OE+CE比较，4%高盐饮食组、8%高盐饮食组均有统计学意义(F=30.614，P<0.01)，4%高盐饮食组与8%高盐饮食组比较，无统计学意义(P>0.05)；与模型组OE%比较，4%高盐饮食组有统计学意义(P<0.05)；与模型组OT %比较，4%高盐饮食组、8%高盐饮食组均有统计学意义(F=50.906，P均<0.01)。

2.2高盐饮食对更年期焦虑症小鼠海马脑GABAAR mRNA的影响与空白组GABAAR mRNA情况(0.271×10-2±0.042)比较，模型组、4%高盐饮食组、8%高盐饮食组均有统计学意义(0.155×10-2±0.220、0.019 6×10-2±0.006、0.030 3×10-2±0.005,P<0.05)；与模型组比较，4%高盐饮食组、8%高盐饮食组均有统计学意义(P<0.01)；4%高盐饮食组与8%高盐饮食组比较，无统计学意义(P>0.05)。

表1　高盐饮食对更年期焦虑症小鼠十字迷宫

与模型组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

3讨论

焦虑症主要表现为发作性或持续性的焦虑、紧张、惊恐不安等焦虑情绪，并伴有自主神经紊乱、肌肉紧张与运动不安等症状〔1〕。研究表明，我国人均吃盐及人均每天食盐摄入量均超标，远远超过世界卫生组织2006年推荐人均日摄入5 g食盐及我国居民膳食指南推荐我国人均日摄入量6 g〔4〕。食盐量的超标会导致一系列的疾病，目前主要集中在高血压、骨质疏松等方面，未见高盐饮食对更年期焦虑症影响的报道。焦虑症的发病机制尚未完全明确，在生化机制方面，主要有神经递质假说和神经内分泌功能紊乱假说〔1〕。但焦虑障碍的发生发展与神经递质(如单胺神经递质、γ-GABA)等关系密切。其中γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物和昆虫中枢神经系统内重要的抑制性递质，其传递作用由GABA受体介导，GABA受体分为3个药理学亚型，即GABAA受体、GABAB受体和GABAC受体，GABAAR受体是三类受体中最重要的一种，它的功能障碍与神经和精神紊乱疾病密切相关〔5〕。GABAAR是一种多功能药物作用靶标，它可以介导抗焦虑药、镇静剂、抗惊厥药、 肌肉松弛和失忆作用〔6〕。王丽丽等〔7〕发现噪音组小鼠GABAAα1/GABAAα3比例下降，慢性持久的噪音暴露使小鼠产生低焦虑样行为。朱伟等〔8〕研究冬虫夏草口服液对焦虑小鼠行为干预效果，结果显示与生理盐水组比较，地西泮组及高剂量虫草绀的山清GABA水平差异有统计学意义；与低剂量虫草组比较，高剂量虫草组血清GABA水平差异有统计学意义；与地西泮组比较，高剂量虫草组血清GABA水平差异显著。周奇志等〔9〕采用不可预知的情绪应激刺激方法建立CES焦虑模型，电针进行干预，运用用免疫组化法检测两脑区GABA的表达，结果显示模型组较空白组大鼠海马和大脑皮质GABA平均光密度(AOD)值明显降低；电针可上调模型大鼠两脑区GABA表达。本研究选择高架十字迷宫造模，EPM为国际公认的测试动物焦虑行为的首选模型，它利用动物对新奇环境的探究习性与对高悬敞开臂的恐惧，形成动物的矛盾冲突心理，通过动物的行为表现考察动物的焦虑情绪〔10〕。本实验结果显示提示高盐饮食可加重动物焦虑程度，减少其活动次数，具有加重焦虑的作用，可能与影响神经递质GABA的表达有关。

4参考文献

1秦莉花，李晟，叶丽芝，等.高盐饮食对更年期焦虑小鼠海马钾离子-氯离子共转运体2、钠-钾-氯离子转运体1表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(2)：270-2.

2黄宽，叶丽芝，李晟，等.高盐饮食对更年期焦虑症小鼠的行为学的影响〔J〕.湖南中医杂志，2013；29(12)：130-2.

3崔同样，黄静，郭海宁.我国居民食用食盐的研究分析〔J〕.内江师范学院学报，2011；26(B07)：189-91.

4孔秋玲，邹江冰，蒋琳兰.焦虑症的生化病理机制研究进展〔J〕.广东医学，2011；32(21)：2869-71.

5郝艳丽，巨修练.GABAAR研究进展〔J〕.武汉华工学院学报，2006；28(2)：11-6.

6Rosah TW，Validation of GABAA receptor subtypes as potential drug targets by using genetically modified mice〔J〕.Curr Drug Targ CNS Neurol Disord，2003；(4)：207-13.

7王丽丽，孟博，顾怡然，等.慢性噪音暴露诱发小鼠低焦虑样行为及其分子机制的研究〔J〕.复旦学报：自然科学版，2011；50(3)：352-9.

8朱伟，张慧，汪家春，等.冬虫夏草口服液抗小鼠焦虑作用的实验研究〔J〕.上海中医药杂志，2011；57(9)：68-70.

9周奇志，赵纪岚，蔡定均.针对慢性情绪应激焦虑大鼠中枢单胺递质与γ-氨基丁酸失平衡的调节作用〔J〕.中华中医药杂志，2008；10：926-9.

10杨红菊，赵楠，龚正华，等.吲哚衍生物I20的抗焦虑作用及机制研究〔J〕.中国药理学通报，2002；18(4)：422-5.

〔2014-08-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者：秦莉花(1980-)，女，讲师，博士，主要从事更年期相关疾病的研究。

基金项目：湖南省教育厅科研项目(No.12C0253)；湖南省“中药学”重点学科资助(No.湘教通〔2011〕76号)

〔中图分类号〕R271.19

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)04-0811-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.018