老年胃癌患者外周血树突细胞功能

2016-03-04黄刚哲

中国老年学杂志 2016年4期

关键词：胃癌

黄刚哲　姜　华

(延边大学附属医院老年病科，吉林　延吉　133000)

老年胃癌患者外周血树突细胞功能

黄刚哲姜华1

(延边大学附属医院老年病科，吉林延吉133000)

〔摘要〕目的探讨树突细胞(DCs)在胃癌疾病的发病机制。方法健康对照者与老年胃癌患者各50例，收集外周血，体外给予10 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素(IL)-4的血清培养液培养，第7天DCs收集细胞及上清，运用流式细胞技术检测DCs表型表达，酶联免疫吸附(ELISA)方法检测细胞上清肿瘤坏死因子(TNF)-α、 IL-12含量变化，同种混合淋巴细胞反应检测DCs刺激淋巴细胞增殖和分化的能力。结果与对照组相比，胃癌组外周血DCs表面表达的CD80、CD86、CD40及主要组织相容性(MHC)Ⅱ数量明显低(P<0.05)；DCs分泌的TNF-α、 IL-12明显低(P<0.05)；DCs吞噬能力明显增加(P<0.05)；DCs刺激淋巴细胞增殖及分化能力明显低(P<0.05)。结论老年胃癌患者外周血DCs呈现未成熟状态，提示DCs与胃癌疾病具有很大的相关性。

〔关键词〕树突细胞；胃癌；成熟

1延边大学附属医院中医科

第一作者：黄刚哲(1964-)，男，副主任医师，主要从事老年病研究。

胃癌致病机制至今未明，但多种研究认为其与免疫因素密切相关〔1〕。树突细胞(DCs)作为机体内最重要的抗原递呈细胞(APC)，在机体起着重要作用。成熟DCs可以高表达多种共刺激因子，如CD86，CD80，CD40，主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ等，高分泌多种细胞因子，如白细胞介素(IL)-12，肿瘤坏死因子(TNF)-α，诱导幼稚的T细胞分化成熟，促进T细胞向TH1/TH2极化，从而激活免疫应答〔2~4〕。本研究旨在探讨DCs在胃癌疾病发生发展中的意义。

1资料与方法

1.1一般资料2013年6月到2015年1月我院消化内科就诊的老年胃癌患者50例为胃癌组，其中男30例，女20例，年龄60～77岁，平均(67.6±11.5)岁。经术后病理检查确诊为胃癌，术前未接受抗肿瘤治疗，且患者心肝功能基本正常，排除自身存在风湿性关节炎、系统性血管炎等其他风湿性免疫性疾病，病毒性肝炎、心梗、糖尿病等影响免疫系统的疾病的患者。健康志愿者50例为对照组，其中男28例，女22例，年龄61～79岁，平均(68.2±10.5)岁。健康志愿者不存在胃癌的临床症状，并且影像学检查未见异常，心肝功能基本正常。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本调查符合伦理学标准，患者与家属知情同意。

1.2标本采集分别收集血液标本8 ml，肝素抗凝。

1.3DCs的分离培养将血液标本与磷酸盐缓冲液(PBS)倍比稀释混匀，严格按照说明书进行步骤操作，将混合液轻轻置于淋巴细胞分离液上，4℃，3 000 r/min，离心30 min。轻轻取出离心管，此时会出现分层，将第二层白膜细胞洗出置于另一离心管中，加入PBS清洗，获得单个核细胞备用。配置含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，并加入巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL-4细胞因子(均购于Peprotech公司)，终浓度均为10 ng/ml。将获得的单个核细胞用上述联合培养基重悬，于6孔板中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。48 h后全量换液，弃去漂浮的细胞，并再加入上述联合培养基继续培养，隔天进行半量换液。继续培养至第7天，收集细胞及上清用于实验检测。

1.4流式细胞仪检测细胞表型收集培养第7天的细胞，与用异硫氰酸酯(FITC)或藻红沅素(PE)标记的流式抗体CD80、CD86、CD40及MHCⅡ(均购于ebioscience公司)混合，4℃孵育30 min，PBS洗涤2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重悬后，上流式细胞仪进行检测，记录结果为阳性细胞所占的比例。

1.5细胞因子检测收集培养第7天细胞上清，严格按照试剂盒说明书，应用IL-10、 IL-12、IL-2及干扰素(IFN)-γ 酶联免疫试剂盒(ebioscience公司)，检测上清细胞因子含量。

1.6吞噬功能检测收集培养第7天的细胞，与用异硫氰酸酯(FITC)标记的抗体右旋糖苷混合，将抗体右旋糖苷作为外来抗原，以吞噬此抗原的细胞含量比例为检测吞噬功能的指标。4℃孵育50 min，PBS洗涤2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重悬后，上流式细胞仪进行检测，记录结果为阳性细胞所占的比例。

1.7同种混合淋巴细胞反应取健康志愿者外周血10 ml，经过淋巴细胞分离液梯度离心后获取单个核细胞，PBS洗涤后，于培养皿中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中，24 h后收集悬浮细胞，视其为淋巴细胞。将收集培养第7天的DCs用丝裂霉素C 25 μg/ml，处理 45 min后用PBS洗涤收集细胞，用10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×106/ml，取100 μl置于96孔板中。并将淋巴细胞也用10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×106/ml，也取100 μl置于96孔板中，使DCs与淋巴细胞混合的最终容积为200 μl，然后置于37℃、5%CO2培养箱培养72 h。于培养结束时进行下续实验：①向每孔加入20 μl的MTS/PMS混合液，培养3 h后，应用光密度仪进行光密度检测，以OD值来反映淋巴细胞增殖程度；②取细胞上清细胞因子分泌来检测T淋巴细胞分化状况。

1.8统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1各组外周血DCs表面共刺激分子表达胃癌组外周血DCs表面表达的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2各组外周血DCs细胞因子分泌胃癌组外周血DCs分泌的TNF-α、 IL-12明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

2.3各组对象外周血DCs吞噬能力胃癌组吞噬能力(2.5±0.6)%，对照组(1.1±0.9)%，外周血DCs吞噬能力明显高于对照组(P<0.05)。

2.4各组外周血DCs刺激淋巴细胞增殖反应胃癌组OD值(1.6±0.5)，对照组(3.2±0.6)，外周血DCs刺激淋巴细胞增殖反应能力明显低于对照组(P<0.05)。

2.5各组外周血巨噬细胞刺激T淋巴细胞分化胃癌组外周血巨噬细胞刺激T淋巴细胞分泌IL-2含量及IFN-γ含量明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1　两组外周血DCs表面共刺激分子、细胞因子分泌、外周血巨噬细胞刺激T淋巴细胞分泌细胞因子表达变化±s,n=50)

与对照组比较:1)P<0.05

3讨论

研究认为胃癌患者体内机体的免疫功能多低下或被抑制，肿瘤对机体的免疫系统产生逃逸。免疫细胞、表皮生长因子受体、细胞因子及细胞黏附分子及其他因素均参与发病〔5〕。其中，T淋巴细胞作为一种重要的免疫细胞，直接参与机体的肿瘤免疫调节。研究表明，胃癌患者外周血的增殖性T细胞能力明显降低；控制肿瘤生长的CD8+T明显降低，调节性T细胞显著升高〔6,7〕。

近年来，随着 DCs 生物学特性和功能的深入研究，发现DCs 的成熟状态是决定其有效呈递抗原的关键因素，会直接影响免疫应答的反应，从而影响机体的各种生命活动〔8，9〕。正常机体绝大多数DCs处于未成熟状态，多位于实体器官及非淋巴组织的上皮，具有较强的抗原摄取能力，但抗原递呈及表达协同刺激分子能力较弱。未成熟DCs摄取抗原后，迁移到引流淋巴结，逐渐发育成熟，成为成熟DCs，高表达MHC类分子及CD80，CD86，CD40等共刺激分子，分泌IL-12、TNF-α等炎性细胞因子，激活T细胞应答，诱导免疫反应〔10〕。然而，DCs也可以分泌抗炎性细胞因子，如IL-10，可通过诱导免疫耐受，或是促进Th2细胞分化来影响免疫反应〔11〕。

本研究提示，胃癌患者外周血DCs呈现未成熟的状态，诱导淋巴细胞增殖及分化能力降低，推测其在调节 Th1/Th2平衡中可能起到重要作用，但仍需进一步研究探讨。

4参考文献

1王成,袁丽萍,殷麟,等.老年胃癌患者胃癌组织中血管内皮生长因子-C、-D、-A、成纤维细胞生长因子-2表达、幽门螺旋菌-L型感染与淋巴结转移的关系〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(7):1841-3.

2邓琼,胡何节,方征东,等.免疫原性和耐受性树突状细胞在粥样硬化动脉壁内的分布及意义〔J〕.中国动脉硬化杂志,2014;22(6):567-73.

3董海影,高志影,荣华,等.姬松茸多糖对树突状细胞Dectin-1、Syk及CARD9基因表达和T淋巴细胞增殖的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2014;20(10):180-3.

4邱波,荆雪宁,武继彪,等.黄芪多糖诱导的树突状细胞疫苗对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用研究〔J〕.南京中医药大学学报,2015;31(1):44-7.

5凌萌智,黄治国,刘扬河,等.mircoRNA-21在胃癌患者血浆中的表达及其与外周血Th1与Th2细胞关系〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(16):4475-6.

6卢芩,俞婷,张有珍,等.胃癌患者外周血及癌组织中调节性T细胞和Foxp3的表达意义〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(18):5140-2.

7王巍,宋玉国,张付喜,等.胃癌及结直肠癌患者外周血CD45 RA+和CD45 RO+T细胞变化特征〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(13):3625-6.

8赵鹏,孙伟红,魏晓芳,等.多西环素对树突状细胞功能的影响〔J〕.菏泽医学专科学校学报,2014;26(4):12-5.

9李望,张升宁,冉江华,等.树突状细胞的培养及成熟的鉴定〔J〕.昆明医科大学学报,2015;36(3):34-7,44.

10李腾飞，苏崇宇，黄刚，等.SAT3信号通路在IL-6抑制人单核细胞来源树突状细胞CCR7表达中的作用〔J〕.第三军医大学学报，2015；37(8)：751-6.