TLR4抑制剂对糖尿病周围神经痛模型大鼠的治疗作用

鲁义++++++姚嘉茵++++++尧新华++++++卿朝晖++++++童辉4++++刘玲

[摘要] 目的 探讨Toll样受体4（TLR4）抑制剂TAK-242对糖尿病周围神经痛（DPN）模型大鼠的治疗效果及其可能的作用机制。 方法 SPF级雄性SD大鼠60只，随机均分为3组，分别为正常对照组（NC组）、DPN模型组（DPN组）、TAK-242治疗组（TAK组）。采用链脲佐菌素（STZ）方法建立DPN大鼠模型，采用ELISA及RT-PCR方法检测DPN模型大鼠腰膨大脊髓组织的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）-TLR4轴上下游基因（HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6）的变化，分析上述细胞因子表达水平与大鼠疼痛行为的相关性。使用TLR4抑制剂TAK-242对DPN模型大鼠进行药物干预，观察其治疗效果及对HMGB1-TLR4轴基因表达的影响。 结果 ELISA检测显示，DPN组大鼠的血清HMGB1、TLR4、IL-6表达水平均较NC组升高（P<0.05）；TAK组大鼠的TLR4及IL-6表达水平较DPN组下降（P<0.05）。RT-PCR检测显示，DPN组大鼠的HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表达水平较NC组升高（P<0.05）；TAK组大鼠的TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表达水平较DPN组下降（P<0.05）。 结论 TLR4抑制剂TAK-242通过阻断HMGB1-TLR4轴对DPN模型动物起治疗作用。

[关键词] TLR4；TAK-242；HMGB1-TLR4；糖尿病周围神经痛

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）02（a）-0009-04

Therapeutic effect of TAK-242 on diabetic peripheral neuropathic pain rats

LU Yi1 YAO Jia-yin2 YAO Xin-hua1▲ QING Zhao-hui1 TONG Hui1 LIU Ling1

1.Department of Anesthesiology，Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China；2.Department of Gastroenterology，the Sixth Hospital Affiliated to Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510655，China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effect and possible mechanisms of TLR4 inhibitor named TAK-242 on the diabetic peripheral neuropathic （DPN） rat model. Methods 60 male SD rats with SPF level were randomly divided into 3 groups， such as normal control group （NC group）， DPN model group （DPN group），TAK-242 treatment group （TAK group）.DPN rat models were established by using the method of streptozocin （STZ），and behavior analysis were made.Expressions of HMGB1-TLR4 related genes such as HMGB1，TLR4，MAPK，NF-κB and interleukin-6 （IL-6） were determined by RT-PCR.Correlations of genes mentioned above and the pain behavior of rats were analyzed.TLR4 inhibitor named TAK-242 was used for drug intervention.Its therapeutic effect and the effect on the expressions of HMGB1-TLR4 axis were observed. Results There was a significant increase in the spontaneous behavior and decrease in the pain threshold of rats in DNP group compared with NC group （P<0.05）.The serum expression of TLR4 and IL-6 in DNP group was significantly higher than those in NC group （P<0.05），and the expression of IL-6 and TLR4 in the TAK group was decreased compared with the model group as detected by ELISA （P<0.05）.The expressions of HMGB1，TLR4，NF-κB and IL-6 mRNA in DNP group was significantly higher than those in NC group （P<0.05），and the mRNA expression of TLR4，NF-κB and IL-6 in TAK group was decreased compared with DNP group as detected by RT-PCR （P<0.05）. Conclusion By blocking the HMGB1-TLR4 axis，TLR4 inhibitor TAK-242 plays a role of therapeutic effect in the treatment on DPN rats.

[Key words] TLR4；TAK-242；HMGB1-TLR4；Diabetic peripheral neuropathic

在糖尿病患者中约20%的患者合并有糖尿病周围神经病变，占糖尿病神经病变的50%[1-2]，其中糖尿病周围神经痛（diabetic peripheral neuropathy，DPN）发病率为13%～26%[3-4]。最新研究认为DPN的发生、发展与全身慢性炎性反应密切相关，尤其周围神经局部免疫功能失常、细胞因子信号传导轴异常相关[5]。其中，高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）-Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）轴可能是神经免疫性损伤的核心病因[6]。本研究拟探讨HMGB1-TLR4轴在DPN发病机制中的作用，使用TLR4抑制剂TAK-242阻断HMGB1-TLR4轴，观察其对DPN的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量180～220 g，由中山大学疼痛治疗中心提供；安排专人采用专用饲料和水进行喂养。实验动物质量合格证：SCXK（粤）2009-0011。实验动物设施使用证：编号0044336。

1.2动物分组

60只大鼠随机均分为3组，分别设为正常对照组（normal control group，NC组）、DPN模型组（DPN model group，DPN组）、TAK-242治疗组（TAK-242 treatment group，TAK组）。

1.3动物模型的建立

采用链脲佐菌素（STZ）法建立模型。大鼠自动物实验中心取回，禁食不禁水24 h。大鼠禁食12 h后称重，按照55 mg/kg一次性腹腔注射STZ溶液（美国Sigma公司）。腹腔注射48 h后用血糖分析仪测定大鼠尾静脉血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L的大鼠为成功的DPN模型大鼠，共得到40只（其中DPN组20只，TAK组20只）。正常对照组则腹腔注射相同剂量枸橼酸/枸橼酸钠缓冲液，共得到20只。

1.4 干预措施

TAK组大鼠，在造模前1天，造模后第1、7天分别按大鼠体重给予腹腔注射3 mg/kg TAK-242[4]（购自美国Takeda公司）。NC组与DPN组分别在相同时间腹腔注射3 mg/kg的生理盐水。造模后第14天结束实验，所有大鼠均麻醉下处死，心脏注射取血，离心后取血清至-4℃冰箱储存；快速取出腰膨大，使用4%多聚甲醛固定，准备行免疫组化检测。留取腰膨大组织2～3 g，置于去RNA酶的Eppendorf管中，经液氮后转至-70℃冰箱，用于RT-PCR检测。

1.5行为学分析

观察大鼠有无自发性疼痛行为。造模后第1、7、14天，在室温（24±1）℃的舒适、安静环境下观察大鼠的歩态和后肢的抬脚、护卫姿势、舔脚、腿的着地性或抗重力行为，以及是否有自残形为。

1.6 ELISA检测

根据试剂盒说明书操作（HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB及IL-6的ELISA试剂盒，均购自美国Invitrogen公司）。检测各组大鼠血清HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB及IL-6的含量水平。

1.7 RT-PCR

取大鼠腰膨大脊髓组织，按Trizol试剂说明书提取肝脏总RNA。采用紫外分光光度计测定总RNA样品的浓度和纯度。取2 g总RNA为模板，反转录成cDNA。PCR反应条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火59℃ 30 s。延伸72℃ 1 min。30个循环后，72℃再延伸10 min。再取5 μl PCR反应产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳拍照。采用Quantity One软件计算待测蛋白的基因和β-actin扩增片断的扫描密度比值。

1.8统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般状态

NC组大鼠毛色有光泽，精神好，爱活动，食量、粪便均正常。DPN组大鼠自实验造模后，活动量减少，精神萎靡不振。TAK组大鼠活动稍差，毛色稍暗，大小便无异常，均无死亡。

2.2各组大鼠行为学的改变

DPN组大鼠自造模第2天开始出现痛觉步态，采取护卫姿势、舔脚等自发行为，造模第14天达到高峰。TAK组大鼠自发行为较DPN组少，第3次注射干预药物后自发行为明显减少。各组大鼠实验过程没有观察到大鼠有自残行为。

2.3 各组大鼠血清中HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6的表达量测定

DPN组大鼠血清中的HMGB1、TLR4、IL-6 mRNA表达均较NC组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。TAK组的TLR4、IL-6 mRNA表达较DPN组下降，差异有统计学意义（P<0.05）。 三组大鼠的MAPK、NF-κB mRNA表达差异无统计学（P>0.05）（图1）。

2.4 各组大鼠腰膨大脊髓组织中HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6 mRNA的表达量测定

DPN组的HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表达均较NC组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。TAK组的TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表达较DPN组下降，差异有统计学意义（P<0.05）。各组大鼠的MAPK mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

3 讨论

目前普遍认为DPN的发病与高血糖及由此带来的一系列代谢紊乱关系密切。国内外研究也表明该病的发生、发展与全身慢性炎性反应密切相关，尤其与周围神经局部免疫功能失常、细胞因子信号传导轴异常相关[7-8]。

HMGB1是关节炎、癌症、自身免疫性疾病和糖尿病发病的关键性中间物质。研究表明，HMGB1在糖尿病患者血浆中水平较高，且HMGB1表达水平与血糖水平高低呈正相关[9-10]。TLR是宿主抵抗病原菌入侵的主要识别和信号传递受体，而TLR4基因缺失小鼠，其神经超敏性降低、脊髓胶质细胞活性和促炎性因子表达也降低[11-12]。在核内，HMGB1与DNA结合，活化下游两种不同信号通路激活——MAPK，NF-κB通路。NF-κB的活化引起IL-6等促炎症因子的合成和释放，如TNF-α和IL-1β，而MAPK通路激活在调节神经元重塑方面有重要作用[13-15]。本研究显示，DPN模型大鼠中血清中的HMGB1、TLR4、IL-6表达量及mRNA表达水平均较NC组升高，差异有统计学意义（P<0.05），说明HMGB1-TLR4在DNP的发病机制中起重要作用。

现阶段，DPN的治疗手段非常有限，在控制血糖的基础上，传统治疗药物包括抗抑郁药、抗惊厥药、抗痉挛药及其他改善局部血流的药物联合运用[16-18]。近年来，比较受关注的是靶向治疗[19-20]。笔者采用TLR4抑制剂TAK-242对大鼠进行干预，结果显示TAK组的大鼠体内TLR4、IL-6 mRNA较DPN组下降，提示TLR4抑制剂TAK-242可以有效阻断HMGB1-TLR4，中断促炎因子的释放及其对机体的损伤，推测可将其作为一种有效的分子靶向治疗方法，为临床治疗药物的研究与拓展提供实验依据。

[参考文献]

[1] 伍雪英，刘玲，龚玉来.加巴喷丁治疗糖尿病性神经痛30例疗效观察[J].临床麻醉学杂志，2008，24（1）：66-67.

[2] Souza M，Kulkarni V，Bhaskaran U，et al.Diabetic peripheral neuropathy and its determinants among patients attending a tertiary health care centre in mangalore[J].J Public Health Res，2015，4（2）：450-448.

[3] Kessler JA，Smith AG，Cha BS，et al.Double-blind，placebo-controlled study of HGF gene therapy in diabetic neuropathy[J].Ann Clin Transl Neurol，2015，2（5）：465-478.

[4] 鲁义，屠伟峰，尧新华，等.两种术后镇痛方式对老年髋关节置换术患者炎性因子表达的影响[J].实用医学杂志，2014，30（23）：3755-3758.

[5] Sadosky A，Mardekian J，Parsons B，et al.Healthcare utilization and costs in diabetes relative to the clinical spectrum of painful diabetic peripheral neuropathy[J].J Diabetes Complications，2015，29（2）：212-217.

[6] Zhang Y，Karki R，Igwe OJ.Toll-like receptor 4 signaling：a common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 （HMGB1） protein-coupled activation[J].Biochem Pharmacol，2015，98（1）：132-143.

[7] Hua F，Tang H，Wang J，et al.TAK-242，an antagonist for Toll-like receptor 4，protects against acute cerebral ischemia/reperfusion injury in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab，2015，35（4）：536-542.

[8] Mitro N，Cermenati G，Brioschi E，et al.Neuroactive steroid treatment modulates myelin lipid profile in diabetic peripheral neuropathy[J].J Steroid Biochem Mol Biol，2014，143（9）：115-121.

[9] Wang WK，Lu QH，Zhang JN，et al.HMGB1 mediates hyperglycaemia-induced cardiomyocyte apoptosis via ERK/Ets-1 signalling pathway[J].J Cell Mol Med，2014，18（11）：2311-2320.

[10] Abu El-Asrar AM，Nawaz MI，Siddiquei MM，et al.High-mobility group box-1 induces decreased brain-derived neurotrophic factor-mediated neuroprotection in the diabetic retina[J].Mediators Inflamm，2013，5（20）：863-866.

[11] Cejkova P，Nemeckova I，Broz J，et al.TLR2 and TLR4 expression on CD14++ and CD14+ monocyte subtypes in adult-onset autoimmune diabetes[J].Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2015，5（4）：110-116.

[12] Good DW，George T，Watts BA.High-mobility group box 1 inhibits HCO3- absorption in medullary thick ascending limb through a basolateral receptor for advanced glycation end products pathway[J].Am J Physiol Renal Physiol，2015，309（8）：720-730.

[13] Lee WH，Wu HH，Huang WJ，et al.N-hydroxycinnamide derivatives of osthole ameliorate hyperglycemia through activation of AMPK and p38 MAPK[J].Molecules，2015， 20（3）：4516-4529.

[14] Tang X，Deng L，Xiong H，et al.Expression profile of mitrogen-activated protein kinase （MAPK） signaling genes in the skeletal muscle & liver of rat with type 2 diabetes：role in disease pathology[J].Indian J Med Res，2014，140（6）：744-755.

[15] Neacsu P，Mazare A，Schmuki P，et al.Attenuation of the macrophage inflammatory activity by TiO2 nanotubes via inhibition of MAPK and NF-κB pathways[J].Int J Nano-medicine，2015，12（10）：6455-6467.

[16] Liao C，Zhang W，Yang M，et al.Surgical decompression of painful diabetic peripheral neuropathy：the role of pain distribution[J].PLoS One，2014，9（10）：342-348.

[17] Kluding PM，Pasnoor M，Singh R，et al.The effect of exercise on neuropathic symptoms，nerve function，and cutaneous innervation in people with diabetic peripheral neuropathy[J].J Diabetes Complication，2012，26（5）：424-429.

[18] Russo GT，Giandalia A，Romeo EL，et al.Diabetic neuropathy is not associated with homocysteine，folate，vitamin B12 levels，and MTHFR C677T mutation in type 2 diabetic outpatients taking metformin[J].J Endocrinol Invest，2015，8（2）：312-321.

[19] Kiani J，Sajedi F，Nasrollahi SA，et al.A randomized clinical trial of efficacy and safety of the topical clonidine and capsaicin in the treatment of painful diabetic neuropathy[J].J Res Med Sci，2015，20（4）：359-363.

[20] Tang F，Xing XW，Chu JM，et al.A highly sensitive fluorescence assay for methyltransferase activity by exonuclease-aided signal amplification[J].Analyst，2015，140（13）：4636-4641.

（收稿日期：2015-10-30 本文编辑：卫 轲）