不孕妇女乙肝病毒感染者的卵巢储备功能研究

柳榴，刘倩，文妍琪，杨菁

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉　430060)



不孕妇女乙肝病毒感染者的卵巢储备功能研究

柳榴，刘倩，文妍琪，杨菁*

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉430060)

【摘要】目的评价乙型肝炎病毒(HBV)感染及HBV-DNA高拷贝数的不孕妇女的卵巢储备功能。方法回顾性分析来院进行体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治疗的505例不孕患者，根据血清HBsAg是否阳性及HBV-DNA滴度将实验对象分为3组：血清HBsAg(-)为A组；血清HBsAg(+)，HBV-DNA<500 IU/ml 为B组；HBsAg(+)，HBV-DNA≥500 IU/ml 为C组。评估3组患者的基本情况，并以血清基础FSH、LH、E2水平和AFC等为指标，分析比较HBV感染状态与卵巢储备功能的关系。结果(1)HBV-DNA阳性率(滴度≥500 IU/ml)在HBV感染的不孕妇女中为48.60%，平均 HBV-DNA拷贝数为5.86×104 IU/ml(5×102～1.28×109 IU/ml)；(2)与A组相比，C组患者中AFC<6的发生率更高(9.62% vs. 2.06%)，差异有统计学意义(P<0.05)；且C组患者在卵巢储备功能低下(AFC<6)的不孕妇女群体中所占的比例显著高于在卵巢储备功能正常(AFC≥6)的不孕妇女群体中所占的比例(45.4% vs. 19.5%，P<0.05)，而A组患者在卵巢储备功能低下的不孕妇女群体中所占的比例明显低于在卵巢储备功能正常的不孕妇女群体中所占的比例(27.3% vs. 59.0%，P<0.05)，B组则在两个群体所占的比例无显著差异(27.3% vs. 21.5%，P>0.05)；(3)多元逻辑回归分析显示，与A组相比，C组卵巢储备功能低下的风险更高[OR 3.689，95% CI (1.043，13.048)](P<0.05)。结论在HBV感染的妇女中，HBV-DNA高拷贝数可能是卵巢储备功能低下的高危因素，其可能会影响不孕女性的卵巢储备功能。

【关键词】HBV；HBV-DNA；不孕；卵巢储备功能

(JReprodMed2016，25(1)：27-31)

卵巢储备功能是指卵巢皮质区卵泡生长发育形成可受精卵母细胞的能力，通常包括两方面：卵巢内存留卵泡数和卵母细胞的质量，它能够综合的反映女性的生育能力[1]。评估女性卵巢储备功能通常所用的指标有：年龄、基础血清卵泡刺激素(FSH)水平、基础血清雌激素(E2)水平、基础 FSH/黄体生成激素(LH)比值(FSH/LH)、卵巢体积、基础窦卵泡数(AFC)及卵巢基质收缩期血流、抗苗勒管激素(AMH)等[2]。一般认为，当FSH>10 U/L、E2>294 pmol/L、FSH/LH>3、AFC<6时均意味着卵巢储备功能低下[3-4]。且目前认为，基础窦卵泡与基础性激素、各种刺激试验相比更能有效评估卵巢储备功能[2]。

HBV作为一种噬肝性病毒，除了存在于肝细胞，还存在于生殖性腺，如卵巢间质细胞、卵母细胞、睾丸等肝外组织，并可通过生殖细胞垂直传播[5]。近年来，在接受辅助生殖技术(ART)治疗的夫妻中发现HBV感染的患者越来越多。已有研究报道HBV能够感染精子，进而影响精子的质量和功能[6-7]。然而对于HBV是否能够影响卵巢的储备功能，目前的研究尚无明确结论。针对这一问题，本研究对进行不孕治疗的女性HBV阳性患者与阴性患者比较，旨在探讨女性HBV感染状态与卵巢储备功能的关系。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2012年4月至2014年12月在武汉大学人民医院生殖中心进行IVF/ICSI-ET治疗的不孕妇女。

纳入/排除标准：年龄≤38岁，无子宫内膜异位症史和卵巢手术史，且排除HCV、HIV和梅毒阳性者。

二、病毒检测及卵巢储备功能参数检测回顾

患者在进行IVF/ICSI-ET治疗前，均常规筛查术前病毒全套。对于血清HBsAg阳性的患者再常规进行HBV-DNA检测，HBV-DNA滴度≥500 IU/ml为阳性；有效期为12个月。进入治疗周期后，常规于月经第2天或第3天采血做性激素全套检测，并测量AFC。

检测方法：采用电化学发光法检测乙肝表面免疫标志物，仪器为ROCHE全自动化学发光免疫分析仪(型号Cobas e601)，试剂为ROCHE仪器配套试剂盒；采用荧光定量PCR (fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR) 法检测血清HBV-DNA，仪器为ROCHE实时荧光定量PCR仪(型号LC480)，PCR试剂盒购自上海复兴生物技术有限公司，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

三、分组及资料收集

根据血清HBV检查结果分组：(1)HBV(-)组：血清HBsAg阴性(A组，n=291)；(2)HBV(+)HBV-DNA(-)组：血清HBsAg阳性，HBV-DNA<500 IU/ml(B组，n=110)；(3)HBV(+)HBV-DNA(+)组：血清HBsAg阳性，HBV-DNA≥500 IU/ml(C组，n=104)。

收集的基本资料包括：年龄、体重指数(BMI)、不孕时间、不孕类型(原发/继发)、病毒筛查结果、基础血清FSH、LH和E2水平及B超下AFC值。

四、统计学分析

数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，计数资料用率(%)表示；对资料进行方差分析、t检验、卡方检验；在调整了年龄、BMI、不孕时间、不孕类型等因素后，使用多元逻辑回归分析对HBV感染状态与卵巢储备功能低下的关系进行了评估。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般资料

本研究共纳入了来我院进行不孕治疗的女性患者505例，其中血清HBV阳性患者214例，血清HBV阴性患者291例。

在214例HBV感染者中血清HBV-DNA 滴度阳性者104例，阳性率为48.60%，DNA 拷贝数为5×102～1.28×109IU/ml，平均为5.86×104IU/ml。

二、各组间临床基础数据的比较

我们对3组患者的年龄、BMI、不孕时间、不孕类型等进行了比较，同时也比较了3组之间月经第2或第3天血清基础FSH、LH、E2水平及基础AFC等指标。结果显示3组间的临床基础数据均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

三、HBV感染与卵巢储备功能下降之间的关系

1.不同HBV感染状况下卵巢储备功能低下的发生率：卵巢储备功能低下的判断标准为AFC<6和/或FSH>10 U/L、FSH/LH>3、E2>294 pmol/L。研究发现，C组中AFC<6的发生率显著高于A组(P<0.05)，且有高于B组的趋势但无统计学差异(P>0.05)；而3组间基础血FSH>10 U/L、FSH/LH>3、E2>294 pmol/L的发生率均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

2.卵巢储备功能与各观察指标及HBV感染状况的关系：我们基于AFC水平(<6或≥6)分析了各项指标与卵巢储备功能低下之间的关系，发现AFC<6的患者年龄显著增高(P<0.05)，而其他各项指标无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表1三组间临床基础数据比较[x-±s，n(%)]

组 别例数年龄(岁)BMI(kg/m2)不孕状况不孕时间(年)原发继发A29130.37±3.7221.82±2.974.62±4.49126(43.30)165(56.70)B11030.53±4.0321.68±2.804.96±3.0258(52.73)52(47.27)C10431.40±4.5821.65±3.404.27±3.4844(42.31)60(57.69)组 别例数FSH(U/L)LH(U/L)E2(pmol/L)FSH/LHAFC(个)A2916.63±2.045.12±3.99167.35±66.431.81±1.0513.22±4.20B1106.89±1.854.59±2.25181.63±65.291.77±0.8013.83±4.64C1046.58±1.744.70±2.86178.58±66.101.78±0.9912.80±5.49

表2三组不同HBV感染状况患者卵巢储备功能低下指标的发生率[n(%)]

组 别例数FSH>10U/LE2>294pmol/LFSH/LH>3AFC<6A29115(5.15)12(4.12)36(12.37)6(2.06)B1106(5.45)6(5.45)10(9.09)6(5.45)C1046(5.77)8(7.69)12(11.54)10(9.62)*

注：与A组比较，*P<0.05

表3卵巢储备功能与各观察指标的关系[x-±s，n(%)]

组 别例数年龄(岁)BMI(kg/m2)不孕时间(年)原发不孕FSH(U/L)FSH/LHE2(pmol/L)AFC≥648330.37±3.9821.64±2.904.59±3.84214(44.30)6.68±1.891.78±0.97154.80±72.52AFC<62235.20±2.70*24.57±4.505.25±4.2810(43.45)7.16±2.221.98±0.63174.44±66.73

注：与AFC≥6组比较，*P<0.05

同时，我们也分析了HBV感染状态与卵巢储备功能低下之间的关系，发现C组的患者在卵巢储备功能低下(AFC<6)的患者中所占的比例大于在卵巢储备功能正常(AFC≥6)的患者中的比例(P<0.05)；相反，A组的患者在卵巢功能下降(AFC<6)的患者中的比例小于在卵巢功能正常(AFC≥6)患者中的比例(P<0.05)；而B组患者与卵巢储备功能低下无关(P=0.52)(表4)。

四、逻辑回归分析

以卵巢储备低下作为应变量，年龄、BMI、不孕时间、不孕类型、HBV感染状态作为因变量，我们对卵巢储备功能低下与HBV感染状态之间的关系进行了多元逻辑回归分析。在调整了年龄、BMI、不孕时间、不孕类型后，与A组相比，C组的卵巢储备功能低下的发生风险显著增大[OR3.689，95%CI(1.043，13.048)](P<0.05)，但是B组卵巢储备功能低下的发生风险与A组相比无统计学差异[OR3.598，95%CI(0.912，14.196);P>0.05](表5)。

表4卵巢储备功能与HBV感染状况的关系[n(%)]

组 别例数HBV感染状况ABCAFC≥6483285(59.0)104(21.5)94(19.5)AFC<6226(27.3)*6(27.3)10(45.4)*

注：与AFC≥6组比较，*P<0.05

表5临床变量、HBV感染状态与卵巢储备功能下降之间的多元逻辑回归分析

参数OR(95%CI)P年龄1.397(1.018-1.653)<0.05BMI1.182(1.022-1.367)0.24不孕时间0.997(0.878-1.132)0.96不孕类型1.606(0.478-5.396)0.88HBV感染状态A组*--B组3.598(0.912-14.196)0.68C组3.689(1.043-13.048)<0.05

注：*参照组

讨论

我国是HBV感染的高发流行区，人群中HBsAg阳性率为7.2%，其中处在婚育年龄人群的HBV携带率近10%[8]。而近年来，在来医院进行IVF/ICSI-ET治疗的不孕女性患者中，血清乙肝表面抗原(HBsAg)阳性或HBV-DNA拷贝阳性的患者比较常见。在HBV感染的患者中，血清中HBV-DNA含量是反映病毒活跃程度最直接、最可靠的指标[9]。本研究主要是分析HBV感染状态与卵巢储备功能的关系。

本研究搜集到感染HBV的不孕患者214例，HBV-DNA 阳性率为48.60%。研究发现，在HBV感染的不孕妇女中，HBV(+)HBV-DNA(+)是卵巢储备功能低下(AFC<6)的高危因素，使卵巢储备功能低下的发生风险增大。窦卵泡是指阴道超声下卵巢内可见的直径2～9 mm的卵泡，是成熟卵泡的前体，AFC能够很好地反应卵泡池中剩余的原始卵泡数，是卵巢储备功能的直接体现[10]。目前认为，基础窦卵泡与基础性激素、各种刺激试验相比更能有效评估卵巢储备功能[2]。Hu等[11]对HBsAg阳性而其配偶阴性的女性进行HBV-DNA和RNA的分析，发现HBsAg存在于卵母细胞的细胞核、细胞质和胚胎。而在卵母细胞或胚胎中的HBV-DNA 能够复制，并且在mRNA和蛋白质水平上表达[12-14]。有研究表明在通过血睾屏障进入睾丸的HBV-DNA在复制的同时还会有一定数量整合到精子染色体，影响精子遗传物质的稳定性进而影响精子的质量，同时，HBV-DNA 表达的部分成分能够导致精子线粒体膜电位的缺失，最终降低精子的活力[15]；另外，HBV感染另一潜在的病理致病机制为：在感染的局部组织通过抗原-抗体复合物的沉积引起局部的免疫反应或炎性反应，导致相关功能的破坏[16-17]。而这些致病机理可能同样适用于整合入卵巢组织和卵母细胞的HBV-DNA。2013年李苗[18]发现HBV感染可以促进卵巢颗粒细胞的凋亡。因此HBV-DNA的感染可能会损伤卵巢组织和细胞，引起卵母细胞储备功能如AFC的改变，而有研究表明AFC<6与卵巢低反应和低妊娠率相关[2]。因此，当血中HBV-DNA大量存在时，能够对卵巢储备功能造成一定的影响。

同时，本研究显示除AFC<6的发生率在HBV(+)HBV-DNA(+)组比HBV(-)组更高外，其余FSH>10 U/L、FSH/LH>3、E2>294 pmol/L的发生率在三组间的差异均不具有统计学意义。推测可能的原因：垂体分泌的FSH、LH是受下丘脑促性腺激素释放激素GnRH及卵巢雌激素的共同协调作用来调控的，卵巢储备功能若受到影响，卵泡数目减少，从而其分泌的雌孕激素会减少，造成对垂体FSH、LH的抑制作用减弱，从而导致血清FSH、LH升高[19]，但是它们的变化比AFC的变化发生的较晚。同时卵巢或卵母细胞中虽然存在HBV-DNA，其含量远远低于血清[20]，卵巢组织或卵母细胞可能会通过某种机制逃避一些HBV-DNA造成的部分免疫伤害。其次，即使存在HBV-DNA整合到染色体，造成遗传物质稳定性的改变，或者在HBV感染局部存在免疫、炎症反应，但是卵巢或卵母细胞同时也存在一定程度的自我修复功能，能修复部分所造成的损伤。因此HBV感染患者中高HBV-DNA滴度对卵巢储备功能或AFC的影响可能还不足以引起FSH、LH、E2等一些指标的明显的改变。

本文的不足之处在于临床样本量有限，因此该结论仍然需要更大样本量的研究来证实。同时，由于临床样本量等原因，本文并没有加入AMH指标，而相比于其他指标，AMH能更早地、准确地评估卵巢储备功能，其灵敏度和特异性与AFC相当[1]。因此，期待着后期能有相关研究针对AMH这一指标来进行进一步的论证。

总之，本研究的初步结果显示，在HBV感染的不孕妇女中，HBV-DNA的高滴度存在是卵巢储备功能低下的高危因素，能促进卵巢储备功能低下的发生。同时由于本研究样本量有限，仍然需要大样本的研究来证实，且其具体的潜在机制有待于进一步的研究。

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[编辑：罗宏志]

Ovarian reserve function in infertile women with HBV infection

LIULiu，LIUQian，WENYan-qi，YANGJing*

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

【Abstract】

Objectives： To evaluate the ovarian reserve function in the infertile women with HBV infection & HBV-DNA high copy number.

Methods： A retrospective analysis based on the medical records of 505 patients undergone IVF/ICSI-ET treatment in the hospital was performed. The patients were divided into three groups according to whether HBsAg existed and the serum titer of HBV-DNA： group A with HBsAg (-)；group B with serum HBsAg (+) & HBV-DNA<500 IU/ml；group C with HBsAg (+) & HBV-DNA≥500 IU/ml. The basic condition and ovarian reserve indicators such as serum FSH，LH，E2levels，and antral follicle count (AFC) in the three groups were analyzed and compared.

Results： The positive rate of HBV-DNA (≥500 IU/ml) was 48.60% in the infertile women with HBV (+). The titer of HBV-DNA varied from 5×102IU/ml to 1.28×109IU/ml with an average of 5.86×104IU/ml. There was a significant higher percentage of AFC<6 in group C compared with group A (9.62% vs. 2.06%，P<0.05). The proportion of patients with DOR (diminished ovarian reserve，AFC<6) was significantly higher than that with normal ovarian reserve (AFC≥6) in group C (45.4% vs. 19.53%，P<0.05). Conversely，the proportion of patients with DOR was significantly lower than that with normal ovarian reserve in group A (27.3% vs. 59.0%，P<0.05). The two proportions were not significantly different in Group B (27.3% vs. 21.5%，P>0.05). Multivariate logistic regression analysis showed that the risk of DOR was significantly higher in group C [odds ratios (OR)： 3.689，95% confidence interval (CI)： 1.043-13.048] compared with group A (P<0.05).

Conclusions： HBV-DNA high copy number may be a high risk factor for diminished ovarian reserve in HBV-infected women. It may affect the ovarian reserve function of infertile women.

Key words：HBV；HBV-DNA；Infertility；Ovarian reserve

【作者简介】柳榴，女，湖北武汉人，硕士，生殖医学专业.(*通讯作者)

【基金项目】国家自然科学基金面上项目(No. 81370767)

【收稿日期】2015-06-09；【修回日期】2015-07-19

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.006