油棕仁贮藏蛋白质亚基组成和含量分析

张 璐,郑亚军,李 艳,张有林*,张润光,张玉峰

(1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119;2.海南大学园艺园林学院，海南海口 570228;3.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌 571339)



油棕仁贮藏蛋白质亚基组成和含量分析

张 璐1,2,郑亚军1,3,李 艳1,张有林1*,张润光1,张玉峰3

(1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119;2.海南大学园艺园林学院，海南海口 570228;3.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌 571339)

油棕(ElaeisguineensisL.)果肉含油率46%～50%，果仁含油率50%～60%，其产油量是花生的7～8倍，有“世界油王”之称[1]。棕油是目前世界上产量和贸易量第一的植物油，可以用作食用油和燃油，也是许多产业的关键原料如纺织、化学品、医药、塑料、清洁剂和润滑剂等[2]。我国于1926年开始引种油棕，目前在海南、云南、广西等省有一定的种植面积，但没有形成规模化的油棕产业，加工业尤其落后。目前，我国的棕油几乎完全依赖进口[3]。

油棕仁粕是棕榈油加工业的副产物，仅菲律宾1年的油棕粕产量就达2 310万t[4]。研究表明，油棕仁粕中蛋白质含量为24.3%[5]，是丰富的植物蛋白质资源。同时，油棕仁粕蛋白质具有较高的营养价值，有较好的溶解性、乳化性及热稳定性[6-7]，开发潜力较大。然而，目前关于油棕蛋白质开发利用和研究报道较少，即使在油棕加工业比较发达的马来西亚、尼日利亚等，脱脂油棕粕也仅被作为饲料和肥料[8]，造成植物蛋白质资源的浪费。

蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，被称为蛋白质的四级结构(Quaternary structure)。研究表明，蛋白质的四级结构对蛋白理化性质和功能活性的影响较大[9]。二硫键是稳定蛋白质四级结构的主要作用力。二硫键的含量和位置影响着蛋白质的一些功能和活性。一些研究表明，二硫键或巯基含量较高的蛋白质或多肽具有较好的还原力和络合金属离子的能力[10]。前期研究也表明，半胱氨酸和甲硫氨酸含量较高的油棕谷蛋白具有较好的抗氧化性和Fe2+络合能力[5]6940。

对油棕仁贮藏蛋白亚基正确的凝胶电泳分离、鉴别和分析，在油棕的资源筛选及加工利用上有重要的意义。笔者采用变性和非变性SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)、Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶电泳方法对油棕仁贮藏蛋白的亚基组成和含量进行研究，试图为油棕蛋白质的进一步利用提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料供试大叶厚壳型非洲油棕杜拉型(E.guineensisJacqL.L.Dura.,简称杜拉型)、非洲油棕丹那拉变种(E.guineensis.Var.tenera，简称丹娜拉型)均由中国热带农业科学院椰子大观园提供。

1.2方法

1.2.1脱脂油棕仁粉的制备。选取油棕，去油棕果肉和果壳，得到油棕仁，粉碎，干燥，按料液比1∶10加入无水乙醚，脱脂8 h，过滤，收集滤渣，反复脱脂3次，在45 ℃干燥2 h，得到脱脂油棕仁粉。

1.2.2油棕仁贮藏蛋白的提取。称取脱脂油棕仁粉，按料液比1∶20加入0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液(含0.4 mol/L NaCl),在4 ℃磁力搅拌提取1 h，在4 ℃ 10 000 × g 离心20 min，收集上清液，调节pH至4.5，在等电点沉淀0.5 h，搅拌15 min，在 4 ℃10 000 × g 离心20 min， 收集沉淀，复溶于ddH2O中，在4 ℃ddH2O中透析24 h，冷冻真空干燥，得到油棕仁贮藏蛋白(Oil palm kernel storage proteins，PKSP )。

1.2.3油棕仁贮藏蛋白的电泳试验方法。

1.2.3.1油棕仁贮藏蛋白的非变性SDS-PAGE[11]。将蛋白质溶液与样品缓冲液按1∶1的比例混合，取15 μl该混合液进行非变性SDS-PAGE凝胶电泳分析。混合液中含0.125 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8),1% (w/V) SDS,0.05 % (V/V) 溴酚蓝和 30%(V/V) 甘油。首先,在不同分离胶浓度(10%、12%、14%和16%)的SDS-PAGE中分离油棕仁贮藏蛋白，确定最佳的分离胶浓度。在恒压电泳时，浓缩胶电压为100 V，分离胶电压为150 V，当溴酚蓝指示剂跑到距胶底部5 mm时停止电泳，剥下胶片后将胶片放入固定液中固定30 min，然后用考马斯亮蓝R-250染色，过夜，放入脱色液中脱色，直至胶片背景蓝色完全透明状，数码照相，在Syngene型凝胶成像系统中分析。

1.2.3.2油棕仁贮藏蛋白的变性SDS-PAGE[12]。为分析油棕仁贮藏蛋白在变性SDS-PAGE下的分离效果，将油棕仁贮藏蛋白溶液与样品缓冲液按1∶1的比例混合，100 ℃煮沸5 min。其中，所用样品缓冲液与“1.2.3.1”基本相同，只是增加了5% (V/V)的β-巯基乙醇。在β-巯基乙醇的作用下，蛋白质的二硫键被打断，各亚基与SDS结合呈棒状且带相同的电荷，因而在SDS-PAGE中亚基按照分子量大小进行分离。取15 μl煮好的油棕仁贮藏蛋白溶液，在浓缩胶为7.5%、分离胶为12.0%的SDS-PAGE中恒压电泳，浓缩胶电压为100 V，分离胶电压为150 V，当溴酚蓝指示剂跑到距胶底部5 mm时停止电泳。染色，脱色，数码照相，在Syngene型凝胶成像系统中分析。为确定亚基的分子量，以低分子量标准蛋白绘制迁移率与分子量的曲线。

1.2.3.3油棕仁贮藏蛋白的Native-PAGE分析[13]。Native-PAGE(非变性凝胶电泳)与SDS-PAGE的步骤基本相同，只是样品缓冲液中不加SDS和β-巯基乙醇，电极缓冲液中也不加SDS。在Native-PAGE 中，蛋白质按照自身的电荷数、分子大小和形状进行分离。将提取的油棕仁贮藏蛋白标定浓度后，按4∶1的比例与样品缓冲液混合，摇匀，点样，进行非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分析。

1.3分析软件采用SYNGENE凝胶成像系统及分析软件和DPS软件，对试验数据进行分析。

2结果与分析

2.1油棕仁贮藏蛋白的SDS-PAGE分析

注：分离胶浓度分别为16%(a)、14%(b)、12%(c) 和10%(d)。Note：The concentrations were 16% (a),14% (b),12% (c) and 10% (d),respectively.图1　油棕仁贮藏蛋白的电泳图谱Fig.1　 Electrophoretogram of oil palm kernel proteins at different separation concentrations

2.1.1最佳胶浓度的选择。在SDS-PAGE电泳中，影响亚基分离的主要因素是分子量。要达到理想的分离效果，就需要选择合适的凝胶孔径。试验浓缩胶浓度为7.5%，分离胶浓度则设置10%、12%、14%、16%共4个水平，研究油棕仁贮藏蛋白在不同的分离胶浓度条件下的分离效果，探讨分离胶浓度对亚基分离效果的影响，寻找最合适的分离胶浓度，比较各分离胶浓度下的电泳图谱，以图谱清晰、差异带明显、条带整体位置等为评判标准。从图1可以看出，在分离胶浓度为16%和14%的凝胶系统中，油棕仁贮藏蛋白小分子量的亚基分得比较开，而大分子量亚基堆积在一起，且各亚基的位置偏上，整体分离效果较差。在分离胶浓度为10%的凝胶电泳系统中，各亚基整体位于分离胶的下部，大分子量亚基的分离效果较好，但小分子量亚基堆积在一起，分离效果较差。因此，分离胶浓度为10%的SDS-PAGE凝胶系统适合于油棕仁贮藏蛋白中较大分子量亚基的分离。

油棕仁贮藏蛋白亚基在分离胶浓度为12%凝胶电泳系统中得到很好的分离。在所得分离胶中，亚基条带清晰，各个亚基间的距离适中，位于胶片上部的大分子量亚基和位于胶片下部的小分子量亚基都得到较好的分离，而且各亚基基本上位于胶片的中部，整体效果也好。因此，分离胶浓度为12%的SDS-PAGE凝胶系统适合于油棕仁贮藏蛋白的分离分析。

2.1.2油棕仁贮藏蛋白各亚基的分子量和含量。采用浓缩胶浓度为7.5%、分离胶浓度为12%的SDS-PAGE凝胶系统，对油棕仁贮藏蛋白进行分析，所得电泳图谱见图2。将电泳图谱采用SYNGENE凝胶成像系统分析各亚基的光密度。在图3中，每个光密度吸收峰都代表一个油棕仁贮藏蛋白亚基，峰的面积代表亚基的百分比含量，而每个吸收峰距离Y轴的距离为该亚基的迁移率。在SDS-PAGE凝胶电泳系统中，蛋白质迁移速率与分子量呈对数型负相关，即蛋白质的分子量越大，它的迁移率越小。

从表1可以看出，油棕仁贮藏蛋白质中主要含有6条亚基，亚基的分子量范围为18.8～51.5 kDa，其中分子量为51.5、30.2、22.1和18.8 kDa的亚基含量最高，约占总数的90%。不同品种油棕仁贮藏蛋白亚基的组成和含量间差异并不显著。

2.1.3油棕仁贮藏蛋白的非变性SDS-PAGE分析。将2种油棕仁贮藏蛋白进行分变性SDS-PAGE凝胶电泳分析。在变性SDS-PAGE凝胶电泳中，β-巯基乙醇将蛋白质分子中的二硫键打断，使蛋白质发生变性；而在非变性SDS-PAGE凝胶电泳中，由于不加β-巯基乙醇等强还原剂，蛋白质中的二硫键不会被破坏，蛋白质的变性几率大大降低，蛋白质分子呈现在自然状态下的亚基组成。因此，比较同一种蛋白质在变性SDS-PAGE和非变性SDS-PAGE凝胶电泳中的亚基组成，可以判断该蛋白质分子中是否含有二硫键。从图4可以看出，油棕仁贮藏蛋白在非变性SDS-PAGE凝胶电泳下分离出5条分子量范围为51.5～20.7 kDa的亚基，而在变性SDS-PAGE凝胶电泳下分离出6条主要亚基，分子量范围为51.5～18.8 kDa。这表明在油棕仁贮藏蛋白质分子中可能含有二硫键。 同时，所选2个品种的贮藏蛋白在非变性和变性SDS-PAGE中的亚基组成均无差异。

注：泳道1.低分子量标准蛋白；泳道2.丹娜拉型油棕仁贮藏蛋白；泳道3.杜拉型油棕仁贮藏蛋白。　Note：Lane 1.Low molecular weight standard protein; Lane 2.Oil palm kernel protein of E.guineensis.var.tenera;; Lane 3.Oil palm kernel protein of E.guineensis Jacq L.L.Dura.图2　油棕仁贮藏蛋白各亚基的电泳图谱Fig.2　Electrophoretogram of subunits in oil palm kernel proteins

注：a.丹娜拉型油棕仁贮藏蛋白;b.杜拉型油棕仁贮藏蛋白。　Note：a.Oil palm kernel protein of E.guineensis.var.tenera; b.Oil palm kernel protein of E.guineensis Jacq L.L.Dura.图3　油棕仁贮藏蛋白的光密度分析Fig.3 Scanning profile of photodensitometry of oil palm kernel proteins

亚基Subunit非洲丹那拉变种油棕蛋白E.guineensis.var.tenera分子量olecularweight∥Da百分含量Percentagecontent∥%大叶厚壳型非洲油棕杜拉型E.guineensisJacqL.L.Dura.分子量Molecularweight∥Da百分含量Percentagecontent∥%151475.11±1.2020.64±3.2351490.79±1.7219.33±0.36237262.18±2.722.33±0.2237363.88±2.792.02±0.57330185.31±1.2818.58±3.7030662.71±1.8317.19±1.10428999.86±1.0210.49±1.8129021.48±2.439.56±0.46522032.79±1.2714.81±3.0422091.54±2.0315.24±0.21618838.41±1.299.31±0.7518824.15±2.7011.72±0.47

注：Mw.低分子量蛋白;1.丹娜拉型油棕仁贮藏蛋白;2.杜拉型油棕仁贮藏蛋白。Note：Mw-Low molecular weight protein; 1. Oil palm kernel protein of E.guineensis.var.tenera; 2.Oil palm kernel protein of E.guineensis Jacq L.L.Dura.图4　油棕仁贮藏蛋白的变性SDS-PAGE(a)和非变性SDS-PAGE(b)凝胶电泳图Fig.4　 SDS-PAGE gel electrophoresis of oil palm kernel storage proteins with β-mercaptoethanol (a) and without β-mercaptoethanol (b)

2.2油棕蛋白的Native-PAGE分析在Native-PAGE凝胶电泳中，由于没有SDS和β-巯基乙醇的加入，蛋白质变性的几率更小。影响蛋白质迁移率的主要因素除了蛋白质的分子量外，还有蛋白质的形状和所带的电荷数。利用非变性电泳，分析蛋白质的天然组分。该试验对油棕仁贮藏蛋白进行了非变性聚丙稀酰胺(Native-PAGE)分析，首先筛选出最佳的分离胶浓度。从图5可以看出，油棕仁贮藏蛋白在浓缩胶浓度为3%、分离胶浓度为5%的Native-PAGE凝胶电泳系统中可以得到较好的分离。在非变性凝胶电泳中，油棕仁贮藏蛋白分离为4个组分。这表明在自然状态下的油棕仁贮藏蛋白是由6个亚基通过二硫键链接成4个组分。这可能是油棕仁蛋白质的四级结构。

注：L1.丹娜拉型油棕仁贮藏蛋白；L2.杜拉型油棕仁贮藏蛋白Note: L1- Oil palm kernel protein of E.guineensis.var.tenera; L2- Oil palm kernel protein of E.guineensis Jacq L.L.Dura.图5　油棕仁贮藏蛋白的非变性电泳图谱Fig.5　Native-PAGE profiles of oil palm kernel storage protein

3结论与讨论

在油棕仁贮藏蛋白的SDS-PAGE分析中，分离胶浓度对椰子蛋白亚基的分离效果有显著影响。研究表明，要想得到最佳的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分离效果，浓缩胶浓度为7.5%、分离胶浓度为12%是最理想的选择。在该试验条件下油棕仁贮藏蛋白分离为6条条带清晰的亚基，分子量范围为18.8～51.5 kDa，所选的两个品种间无显著差异。Morcillo等[14]曾对油棕胚中蛋白质进行分析，发现油棕蛋白中主要含中小分子量亚基。这与该研究结果相一致。比较油棕仁贮藏蛋白的非变性SDS-PAGE和变性SDS-PAGE，发现油棕仁贮藏蛋白的多肽链间含有一定量的二硫键。

综合分析油棕贮藏蛋白质的SDS-PAGE和Native-PAGE，可以推测在自然条件下油棕仁贮藏蛋白质所含的6条主要亚基通过二硫键等非共价键链接成4个分子大小不一、带有不同电荷的组分。这4个组分再构成油棕仁贮藏蛋白质分子。然而，目前对各亚基之间的连接方式未弄清楚，而对亚基的含量与油棕仁贮藏蛋白营养价值、功能特性和活性之间的关系仍需要进一步开展研究。

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摘要[目的]为油棕仁中蛋白质的进一步研究与开发利用提供指导。[方法] 采用非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对油棕仁中贮藏蛋白质亚基进行研究，分析油棕仁蛋白主要亚基的组成、分子量、含量、二硫键的位置及种间差异。[结果] 油棕仁中贮藏蛋白质在浓缩胶浓度为7.5%、分离胶浓度为12%的SDS-PAGE凝胶系统中可以得到很好的分离。在油棕仁贮藏蛋白中含有6条主要亚基，分子量范围为18.8 ～51.5 kDa，主要是中、小分子量亚基；各亚基之间含一定量的二硫键。非变性凝胶电泳分析表明，油棕仁贮藏蛋白中含有4个不同分子量、不同电荷的组分。[结论] 该研究所选的不同油棕品种之间亚基的组成和含量没有显著性差异。

关键词油棕仁; 贮藏蛋白; 亚基; SDS-PAGE

Study on Subunits of Oil Palm Kernel Storage Proteins

ZHANG Lu1,2, ZHENG Ya-jun1, 3, LI Yan1, ZHANG You-lin1*et al (1. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi 710119; 2.College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228; 3.Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropic Agriculture Science, Wenchang, Hainan 571339)

Abstract[Objective] The research aimed to provide the guidance for the further study and the development and utilization of protein in oil palm kernel. [Method] The subunits of storage proteins in oil palm kernel were studied by SDS-PAGE and Native-PAGE, including their content, molecular weight, content of disulfide bonds and variance difference. [Result] Storage proteins in oil palm kernel were well separated by SDS-PAGE with 12% separation gel and 7.5 % pile gel. Under this condition, the storage proteins in oil palm kernel were separated into 6 main subunits, with a molecular weight range of 18.8～51.5 kDa. This meant that the main subunits were lower molecular weight in oil palm kernel storage proteins. Compared with the result of SDS-PAGE with Native-PAGE, there were some disulfide bonds among the subunits of oil palm kernel storage proteins. There were four peptides with different molecular and different electric charge separated by Native-PAGE. [Conclusion] There was no significant difference between the two kinds of oil palm.

Key wordsOil palm kernel; Storage protein; Subunits; SDS-PAGE

收稿日期2015-11-30

作者简介张璐(1993- )，男，四川成都人，本科生，专业：园艺学。*通讯作者，教授，博士生导师，从事农产品加工及贮藏方面的研究。

基金项目国家科技支撑项目(2012BAD31B03)；海南省重大科技项目 (ZDZX2013011)。

中图分类号S 789.5;TS 201

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-008-04