六君子汤对皮肤屏障功能障碍小鼠的影响

杨皓然++方凯++孙晓菲++解宇环

【摘要】 目的：观察六君子汤对皮肤屏障功能障碍小鼠的影响。方法：采用胶带法复制皮肤屏障功能障碍小鼠模型，观察正常组、模型组和六君子汤给药组小鼠经皮水分丢失量（TEWL）和神经酰胺含量的差异。结果：模型组小鼠TEWL值上升（P

【关键词】 六君子汤；皮肤屏障功能障碍；经皮水分丢失量；神经酰胺

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517（2015）24-0012-02

皮肤屏障包括皮肤的机械屏障、免疫屏障、神经屏障以及其他与皮肤功能相关方面，狭义的皮肤屏障常指表皮，尤其是角质层的机械性屏障。机械屏障直接与外界接触，是机体与外界环境之间的屏障。该屏障对外界物理性、化学性、细菌等微生物损伤具有防护作用，并有助于维持皮肤的完整性，防止体内营养物质、水份等的丢失。皮肤屏障功能的障碍可诱发湿疹、特应性皮炎、银屑病等皮肤疾病。中医临床治疗本类疾病过程中，无论哪一种证型，都应兼顾脾胃，而健脾法是治疗皮肤屏障障碍相关疾病的重要方法。本研究选用益气健脾经典方剂六君子汤，观察其对模型小鼠皮肤机械屏障障碍的影响，以初步探讨健脾方药对皮肤机械屏障功能的作用。

l 仪器与材料

1.1 动物 SPF级ICR小鼠，雌雄各半，体重18-22g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。合格证号：SCXK（京）2014-0004。

1.2 药品与试剂六君子汤：人参36g，茯苓36g，炒白术36g，炙甘草24g，陈皮12g，半夏18g，药材购自昆明市“一心堂”连锁药店，均由中药鉴定教研室张洁老师鉴定为正品。按方中比例水煎、过滤、浓缩制成浸膏，4℃保存；神经酰胺标准品（美国sigma aldrich公司）；胰酶（Lot No：MR28175，法国）；其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器YLS-Q4耳肿打耳器（直径为8mm，山东省医学科学院设备站）；HX086146薄层色谱硅胶板（德国Merck公司）；Vapo Meter测量仪（芬兰Delfin Technologies公司）。

2 方法

2.1 动物分组及处理将健康ICR小鼠，根据体重分层随机分为5组。即正常对照组、模型组、六君子汤高、中、低剂量组。除六君子汤各组分别灌胃给予不同浓度的的六君子汤水煎液外，其余各组灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，连续13d。除正常对照组外，其余各组从给药第9天起，以胶带法复制皮肤机械屏障障碍模型，连续5d。造模各组于造模前l天，剃去小鼠颈背部被毛。

2.2 表皮经皮水分丢失量（TEWL）测定 造模第5天，用Vapo Meter测量仪测定小鼠颈背部皮肤TEWL值，室温20-25℃，空气相对湿度50%-60%。测量仪器与测量部位皮肤表面垂直接触，每一测试部位测量3次，读出数值并记录，取其平均值。

2.3 表皮神经酰胺含量的测定

2.3.1 表皮脂质的提取造模第5天，检测完TEWL值后将小鼠处死，取下颈背部皮肤，用打耳器打成面积约为50mm²大小的皮肤圆片共6片。将所取皮片浸泡于胰酶中，37℃水浴th，4℃冰箱放置过夜后取出，分离表皮，抽提表皮脂质，氮气吹干，-80℃冰箱保存。

2.3.2 对照品的制备称取神经酰胺对照品5.0mg，置5ml容量瓶中，加氯仿适量，振摇溶解，定容后从中精密吸取Iml溶液，加氯仿定容至5ml，即得0.2mg/ml对照品溶液。

2.3.3 线性关系考察 精密吸取2、4、6、8、10、12、14μl神经酰胺对照品溶液点于薄层板上展开（展开剂为正己烷一乙酸乙酯=3：1），晾干后再于氯仿一甲醇一氨水（90：10：0.5）中展开；喷洒显色剂于140℃下烘干显色。显色后采集图片并用Image J软件分析，测定灰度值。经计算得到回归方程），=5346.3x+4222.2，R²=0.9973，线性关系良好，线性范围为0.4-2.8μg。

2.3.4 神经酰胺含量测定 吸取对照品溶液、供试品溶液，按上述条件测定灰度值，最终换算出神经酰胺含量。

2.4 统计学方法实验数据用（x+s）表示，方差齐的组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差不齐的采用秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 对皮肤TEWL值的影响由表1可知，与正常对照组比较，皮肤屏障功能障碍小鼠TEWL值增加（P<0.01）；与模型对照组比较，六君子汤三个剂量组均能降低TFWL值（P<0.01）。

3.2 对神经酰胺含量的影响 与正常对照组比较，皮肤屏障障碍小鼠神经酰胺含量降低（P<0.05）；与模型对照组比较，六君子汤高、中剂量组均能增加神经酰胺含量（P<0.05）。见表2。

4 讨论

有学者将皮肤屏障比喻为“砖墙”结构，角质细胞好比“砖”，而细胞问脂质好比“灰浆”，它将角质细胞紧密地连接起来，使皮肤屏障功能正常。细胞间脂质主要是由胆固醇、脂肪酸和神经酰胺以适当的比例组成。研究发现，神经酰胺约占总脂质的50%，是脂质的主要组成成分，在皮肤屏障修复中起主要作用，若除去神经酰胺就能使表皮层屏障功能几近丧失。阻止水分经皮扩散和丢失，这是皮肤最重要的屏障功能之一，TEWL反映的是水从皮肤表面蒸发量，所以是评价皮肤屏障功能的重要指标，TFWL值越高，说明经皮肤散失的水分越多，角质层的屏障功能也越差。

研究采用胶带法破坏小鼠皮肤屏障后，导致小鼠皮肤TEWL值上升的同时表皮神经酰胺含量下降，表明小鼠皮肤机械屏障功能受损。而六君子汤给药后，小鼠TEWL值下降，小鼠皮肤机械屏障功能得以恢复。说明六君子汤能改善小鼠皮肤机械屏障功能，其机制与增加表皮神经酰胺含量有关。