白术多糖对胃癌细胞SGC—7901凋亡的影响

王鹤++陈拥军++张中华

【摘要】 目的：探讨白术多糖对胃癌细胞SGC-7901凋亡的诱导作用。方法：采用不同浓度（30、60.120mg/ml）、不同时间（24、48h）白术多糖注射液处理SGC-7901细胞。流式细胞仪检测细胞凋亡，Westernblot检测Bax、Bcl-2蛋白表达，RTRCR检测p53mRMA。结果：白术多糖注射液对SGC-7901细胞体外凋亡具有促进作用，并呈现剂量及时间成正相关；白术多糖注射液处理后，SGC-7901细胞Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2蛋白表达比值显著升高，Bcl -2蛋白表达显著降低，并呈现剂量及时间依赖性；SGC-7901细胞P53mRNA表达随白术多糖浓度的增高而增强。结论：白术多糖促进人胃癌细胞SGC-7901的凋亡，其作用机制可能与上调Bax、p53mRWA和下调Bc1-2表达有关。

【关键词】 白术多糖SGC-7901；细胞凋亡；机制研究

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517（2015）24-0010-02

白术为我国常用中药之一，为菊科植物白术（Atrac-tylodes macrocephala Koidz）的干燥根茎，其性温，味甘苦，具有健脾益气、燥湿利水的功效，临床用于治疗脾胃气弱、泻泄、汗出、胎动不安等。药理研究表明，多糖是中草药发挥独特疗效的重要物质基础，并发现白术多糖能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。研究采用体外培养方法，观察了不同浓度白术多糖对人胃癌细胞株sGc-7901凋亡和对Bax、Bcl-2、P53mRNA表达的影响，为白术多糖抗胃癌的临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 胃癌细胞株SGC-7901（中南大学湘雅医院肿瘤研究所）；白术多糖（陕西慈缘生物技术有限公司）；小牛血清、1640培养基、胰蛋白酶、PBS缓冲液（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；Bcl-2、Bax单抗（Santa Cruz公司）；凋亡试剂碘化丙啶（ PI）和Annexin-V-FITC凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；Trizol试剂（ invitrogen）；DSS（Sigma公司）；Taq酶（鼎国公司）；逆转录试剂盒（promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养常规复苏胃癌细胞株scc-7901，按贴壁方法培养，用含有双抗（每lOOml分别含青霉素1万单位和链霉素lOmg）及10%胎牛血清的DMEM培养液，然后用灭菌的5.6% NaHC03调pH值至7.2，置于37℃、5%C0₂培养箱中培养，每48h用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞凋亡率检测 收集对数生长期细胞，DMEM培养液调整细胞浓度为3×104个/ml，将细胞加至96孔板，sooμL/孔，另设不加细胞只加培养液的空白对照孔。将细胞置于37℃、5%C0₂温箱中培养12h后，加入终浓度为30、60、120mg/ml的白术多糖并在不同时间点（24、48h）对SGC-7901细胞进行预处理，每组设3个复孔，共4组。细胞置37℃、5%C0₂温箱中培养，培养结束后1200r/min，离心4min，弃上清液，用流式细胞仪按照试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.3

Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达 30、60、120mg/ml白术多糖注射液处理细胞48h后，提取胞质蛋白，按照Western blot操作步骤进行Bax、Bcl-2蛋白表达检测。

1.2.4

RT-PCR检测p53mRNA 用Trizol提取总RNA，然后进行逆转录（ RT）及多聚酶链式反应（PCR）。基因扩增条件为：94℃变性1min，62℃退火1mm，72℃延伸1min；进行31个循环，最后54℃ lOmin结束反应。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下观察并拍照，用Flour Chem V2.O凝胶成像分析软件分析不同组别DNA扩增带的灰度值，以灰度值（p53）/灰度值（β-actin）作为基因p53mRNA的半定量指标。引物由上海生工公司合成，具体如下。

1.2.5 统计学方法数据采用SPSS196.0进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料比较采用X²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白术多糖对SGC-7901细胞体外凋亡率的影响 实验中观察到各组胃癌细胞数明显减少，胞体椭圆变形多发，同时可见细胞坏死碎片。从表2可知，在不同预处理时间点，不同浓度白术多糖对人胃癌SGC-7901细胞体外凋亡具有促进作用，且与作用时间和处理剂量呈现正相关性。白术多糖浓度越高则对SGC-7901凋亡促进作用越明显（P

2.2 白术多糖对SGC-7901细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响不同浓度白术多糖处理人胃癌SGC-7901细胞48h后，Bcl-2蛋白表达显著降低，而Bax蛋白表达显著升高，前者与白术多糖浓度呈负相关，后者与白术多糖浓度呈正相关，说明二者可能与白术多糖促进SGC-7901细胞的凋亡机制相关，具体见表3。

2.3 白术多糖对SCC-7901细胞p53mRNA表达的影响由表4可知，随着白术多糖浓度的增高，SCC-7901细胞p53mRNA表达逐渐增强，说明白术多糖对促进SGC-7901细胞凋亡与p53基因有关系。

3 讨论

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着重要的作用，对生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育起着重要的作用。细细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。一个严密完整的程序化死亡过程，需在基因表达的激活、特定信号转导通路的启动等调控下进行的自性、有序性死亡，是维持细胞内环境稳定的重要机制。

白术多糖是一种多效的天然活性物质，具有明显的免疫增强作用，白术多糖能显著增加小鼠胸腺和脾脏质量，能提高大鼠外周血白细胞的含量及血清免疫球蛋白和补体水平，增加NBT阳性率和血清溶菌酶的含量，促进外周血、脾脏T/B淋巴细胞转化率。Zhang等研究发现，注射白术多糖后能明显减小S180荷瘤小鼠和Lewis肺癌小鼠的瘤重和瘤体比，明显抑制肿瘤的生长，说明其能降低瘤细胞的增殖率。实验中，白术多糖干预后，胃癌细胞SGC-7901凋亡率能明显提高，还可促进Bax蛋白表达的上调和Bcl-2蛋白表达的下调以及上调p53mRNA的表达。研究发现，Bcl-2是抑制细胞凋亡基因，而Bax是促进细胞凋亡的基因，二者是调控细胞凋亡的重要组成部分。p53基因定位于人类染色体17p13.1，由11个外显子组成，编码393个氨基酸组成的53 000的核内磷酸化蛋白，全长约20kb。其参与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、凋亡等，其激活可加快肿瘤细胞的凋亡。

综上所述，白术多糖可能通过上调Bax、p53mRNA和下调Bcl-2表达促进人胃癌细胞SGC-7901的凋亡，但其是否可以诱导其他基因，以及具体介导通路仍需深入研究和探讨。