外植体选择和灭菌对杧果组织培养影响的初步研究

岑湘涛 沈伟

摘 要：该文以杧果为试验材料，研究了不同外植体与不同灭菌方法对杧果组织培养的影响。试验结果表明：杧果组织培养适宜外植体为室内沙培杧果带腋芽茎段；最适灭菌处理为酒精30s+0.1%HgCl2灭菌8min。

关键词：杧果；外植体；组织培养；灭菌

中图分类号 S66 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）02-16-02

杧果（Mangifera indica Linnaeus）为漆树科（Anacardiaceae）杧果属（Mangifera Linnaeus）植物，是我国重要的热带果树之一。其果实芒果具有独特的风味，富含维生素，被誉为“热带水果之王”，已在热带、亚热帶多个国家及地区广泛种植[1]。杧果种子在贮藏时极易失去生活力，所以一般多采用无性繁殖[2]。利用组织培养技术建立杧果快速繁殖体系，能在较短时间和较小空间内获得大量纯合无性系组培苗，对加速杧果良种繁育推广有着积极的意义。本文就杧果茎段离体培养中的外植体选择和灭菌进行了探索性的研究，以期为杧果组培快繁体系的完善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本研究供试品种为桂七杧，品种来源及特征特性如下：桂七杧又名桂热82号，树势中等，枝条开张花期较迟，属晚熟品种，成熟期8月中、下旬。丰产稳产。桂热杧82号主要在百色市田东县及南宁市种植。2014年百色市杧果种植面积8.66万hm2，投产面积1.43万hm2，年产量17.43万t，杧果总产值6.28亿元[3]。本试验以桂七杧带腋芽茎段为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 取材地点和取材天气 取材地点设：A室外基地植株，B实验室沙盆植株，共2个地点。取材天气设：a连续阴天的一天，b雨后第二天，c连续晴天的一天，取材时间都为中午14：30左右。

1.2.2 外植体的预处理 从室外基地及室内沙盆植株中选择生长良好的枝条，剪取距幼嫩植株顶端约15cm长的茎段，去除顶端3节，剪去叶片，留1cm叶柄。将材料用洗衣粉溶液浸泡10～15min，再用自来水冲洗10～15min，放在超净工作台上。

1.2.3 不同灭菌处理对不同类型外植体灭菌效果的影响 在超净工作台里，分别采用以下的灭菌方法对不同类型杧果外植体进行灭菌：（1）75%酒精浸泡30s，振荡，弃去浸泡液，无菌水冲洗1次，加有吐温的0.1%HgCl2的溶液浸泡加摇晃7min，弃去浸泡液，无菌水冲洗5次；（2）75%酒精浸泡30s，振荡，弃去浸泡液，无菌水冲洗1次，加有吐温的0.1%HgCl2的溶液浸泡加摇晃8min，弃去浸泡液，无菌水冲洗5次；（3）75%酒精浸泡30s，振荡，弃去浸泡液，无菌水冲洗1次，加有吐温的0.1%HgCl2的溶液浸泡加摇晃9min，弃去浸泡液，无菌水冲洗5次。

1.2.4 培养基及培养条件 将已进行灭菌处理的茎段切成约芽上0.5cm，芽下1cm，叶柄0.5cm的单芽茎段，分别接种至MS培养基中。试验材料均在25±5℃的培养室中培养，每天光照10h，光照强度1 600～2 000lx。7d后开始观察外植体污染及腋芽萌发情况，并统计污染率及萌发率。计算公式如下：

污染率（%）=污染的外植体个数/接种的总外植体个数×100；

无菌率（%）=100-污染率；

褐化率（%）=褐化的外植体个数/接种的总外植体个数×100

2 结果与分析

2.1 不同取材地点和取材天气对外植体灭菌效果的影响 由图1、图2可知，对于室外基地取材，连续阴天和雨后天气取材以及连续晴天取材，灭菌效果都很差，外植体接种的无菌率分别为13.3%、5.6%、17.8%，褐化率都为100%，可以看出连续晴天取材，灭菌效果略好，但污染仍较严重；对于室内沙盆取材，连续阴天、雨后及连续晴天取材灭菌效果差异不显著，无菌率分别约为93.3%、90%、93.3%，褐化率分别为64.4%、65.6%、64.4%。试验结果表明，取材地点对于灭菌效果影响很大，大田取材灭菌效果很不理想，而室内沙盆取材灭菌效果较大田取材好。取材天气对灭菌效果也有影响，但对于不同的取材地点影响程度不同，对于室外基地植株影响很大，而对于室内植株则影响很小。因此，以室内栽培植株为外植体，可得到很理想的灭菌效果，若以室外栽培植株为外植体，则建议晴天取样。

2.2 灭菌处理对不同类型外植体灭菌效果的影响 试验中酒精灭菌时间固定为30s，0.1%HgCl2的灭菌时间设7、8、9min3个处理，7d后观察并记录外植体的污染和褐化情况，试验结果见图3、图4。升汞是重金属盐杀菌剂，0.1%HgCl2溶液是一种灭菌效果很好的灭菌剂，但消毒时间要求极为严格，如果时间过短，杀菌不彻底，外植体污染严重。时间过长，会对组织细胞有杀伤作用，导致植物组织褐化严重会导致外植体死亡。由图3及图4可知，在的杧果外植体灭菌过程中，室外基地取材的外植体灭菌效果不理想，3种灭菌处理的外植体褐化率达到100%且外植体无菌率都低于25%，3种处理差异不显著。相较于室外基地取材，室内沙培植株杧果外植体的无菌率最高能达到93.3%，3种处理差异不显著但褐化率随着灭菌时间的延长而提高。

3 结论与讨论

外植体选择和灭菌是杧果组培快繁体系建立的关键环节，从试验结果可知，外植体取材地点应该是杧果组培外植体选择的关键因素，取材天气对于室内植株则影响很小，室内沙盆取材灭菌效果较大田取材好。原因可能是微生物的生长和活动与外界环境有一定的关系，温暖潮湿的环境容易滋生各种菌类，有利于微生物的繁殖室外大田环境复杂，可能存在的菌类种类和数量相对室内来说较多，且大田植株直接与地面接触，植物体上尘土较多，因此附着在植物体上的菌类多且复杂，灭菌很困难[4]。而室内环境则相对比较稳定，植株带菌量少，同样的灭菌处理便可得到更好的效果。因此，建议选择室内沙培植株带腋芽茎段作为建立杧果组培快繁体系的外植体。从灭菌效果和腋芽萌发率2方面因素综合考虑，室内沙培杧果带腋芽茎段最适灭菌处理为酒精30s+0.1%HgCl2灭菌8min。

参考文献

[1]铁万祝，罗关兴，王友富，等.我国杧果产业发展概况与主要问题[J].中国热带农业，2013（5）：16-19.

[2]F.CorbineauM.kanteD.Come.杧果种子萌发及幼苗生长[J].种子，1990（2）：72-73.

[3]平少华.杧果的前世今生[J].中国果蔬，2015（5）：45-48.

[4]朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌[J].植物生理学通讯，1996，32（6）：444-949. （责编：张宏民）