番茄红素改善移植血管内皮功能

徐自强 张 岩 沈龙捷

(温州医科大学附属第一医院， 浙江 温州 325000)

番茄红素改善移植血管内皮功能

徐自强 张 岩 沈龙捷

(温州医科大学附属第一医院， 浙江 温州 325000)

目的 探讨番茄红素对大鼠移植血管内皮功能的改善作用。方法 实验分为两组：实验组，Lewis 大鼠接受Brown-Norway(BN)大鼠腹主动脉移植；番茄红素干预组(30 mg·kg-1·d-1)，Lewis 大鼠接受BN 大鼠腹主动脉移植。于移植后28 d取移植动脉,进行组织形态学观察、测量内膜厚度，免疫组化检测血管内iNOS和ICAM-1表达。收集各组血浆， ELISA检测cGMP浓度。结果 各组血管内膜均出现增厚；番茄红素干预组血管内膜增厚与实验组相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化检测结果显示, 与实验组相比, 番茄红素干预组移植动脉iNOS表达增高(P<0.05)。结论 番茄红素通过调控NOS通路，改善内皮功能，缓解移植动脉的纤维化进程以及内膜的增生。关键词：番茄红素；移植物闭塞；移植

近年来，移植物的近期存活率已显著改善。然而，移植物长期存活率并没有明显提高，这主要是由慢性排斥反应导致。移植物慢性排斥反应共同病理学特征是血管病变。在移植物血管病的发生发展中，早期血管内皮受损是导致移植物血管壁结构改变和增殖的始动因素[1]。番茄红素(Lycopene, Lyc)是最有效的单线态氧灭活剂[2]。Lyc具有血管内皮保护和抗血管平滑肌细胞增殖的作用。本研究旨在探讨Lyc对早期的慢性移植物血管病变的影响和可能机制，为营养干预防治慢性排斥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

供体为雄性 Brown-Norway(BN)和Lewis大鼠各16只，体质量200～250 g。大鼠环磷酸鸟苷(cGMP)ELISA试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供。兔抗iNOS单克隆抗体和兔抗ICAM-1单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。番茄红素为美国赫力仕公司产品。

1.2 大鼠腹主动脉移植模型建立

切取供体大鼠腹主动脉1.0～1.5 cm。受体大鼠取腹正中切口，暴露腹腔，于肾动脉分支下、髂动脉分支上分离腹主动脉，无创血管夹夹闭后，离断腹主动脉，用10～0血管缝合线将供鼠离体血管与受鼠腹主动脉端端缝合。

1.3 实验分组

实验共分两组。移植实验组：以BN大鼠为供体，Lews大鼠为受体，共8只；移植Lyc干预组：以BN大鼠为供体，Lews大鼠为受体，共8只，手术当天开始使用Lyc灌胃，30 mg·kg-1·d-1。术后 4周处死受体。取出移植动脉用于病理学检查及免疫组化检测。收集血浆检测环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)浓度。

1.4 移植动脉组织病理学变化的观察

切取大鼠的移植动脉用10%甲醛固定后石蜡包埋、切片，行HE染色。应用真彩色病理图像分析系统(JD-801型，江苏捷达)观察移植动脉的病理变化情况。每个标本在高倍视野下随机取5个视野，量取移植动脉内膜和中膜厚度，测量两者比值。

1.5 外周血浆cGMP的检测

大鼠血浆cGMP的含量测定，采用酶联免疫法(ELISA法)检测。所有操作均按照试剂盒说明进行。

1.6 iNOs和ICAM-1表达

移植动脉经甲醛固定、包埋，4 μm切片。二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，3%过氧化氢室温20 min灭活内源性过氧化物酶，兔血清封闭20 min。甩干后滴加兔抗iNOs单克隆抗体(1：200稀释)和ICAM-1单克隆抗体(1：100稀释)，阴性对照以PBS代替。生物素标记羊抗兔二抗(1：100稀释，37 ℃孵育2 h)，每步之间均以PBS洗涤(5 min×3次)，DAB显色，苏木精复染后脱水封固镜检。每张切片在400倍光镜下随机采集5个不重叠视野，棕黄色为阳性染色区，采用图像定量分析系统测量每个视野阳性细胞数，计算平均值。

1.8 统计方法

2 结 果

2.1 组织学表现

移植实验组和Lyc干预组术后4周出现典型的移植相关动脉硬化，内膜呈增生，管腔狭窄，新生内膜见大量纤维细胞增生，内膜可见单核细胞浸润。但干预组内膜增厚程度轻。干预组内膜和中膜比值(0.378±0.133)，同实验组比较(0.572±0.201)，P<0.05，有统计学差异。

2.2 免疫组化检测iNOS和ICAM-1表达

移植物血管平滑肌层iNOS表达阳性细胞计数，发现实验组(4.80±1.11)和Lyc干预组(5.78±1.76)。两者比较P<0.05，有统计学差异。Lyc干预组iNOS的表达升高。移植血管ICAM-1表达，实验组和干预组比较[(24.10±3.35)：(22.75±3.29)],P>0.05,无统计学差异。

2.3 ELISA检测血浆中cGMP水平

术后4周收集大鼠的血浆，采用ELISA检测cGMP浓度：实验组(47.37±7.97 pmol/mL)和Lyc干预组(55.46±12.05 pmol/mL)。两者比较P>0.05，无明显统计学差异。

3 讨 论

HONG等发现在大鼠移植动脉硬化病变模型中，iNOS在调控移植血管内膜增厚中发挥重要作用：iNOS上调可以引起NO及cGMP增加，NO可以直接阻碍血管内血小板和白细胞聚集，抑制黏附分子和趋化分子的表达[3]。cGMP浓度升高，一方面使细胞内肌浆网摄取钙离子增加，并且抑制钙离子通道，减少钙离子内流，使平滑肌细胞内钙离子浓度下降，扩张血管；另一方面，可以抑制RhoA激酶的活性，调控血管收缩，促进血管平滑肌细胞增殖。因此我们推测通过调控NO/cGMP，维持移植物血管收缩和舒张平衡是早期防止移植物血管病变的关键因素。

Lyc是最主要的类胡萝卜素之一，具有很强抗氧化作用。研究发现长期服用番茄红素，可以清除氧自由基，增加NO-cGMP含量，有效抑制动脉粥样硬化的形成[4]。但对于慢性移植物血管病变未见报道。研究发现移植术后4周，实验组和Lyc干预组均出现慢性移植物血管病变改变，表现为移植血管内膜的增厚，平滑肌细胞增殖并向内膜迁移，但Lyc干预组内膜增生较实验组减轻。iNOs表达在干预组中较实验组明显增加。Lyc干预组血浆中cGMP浓度同实验组比较，无统计学差异。cGMP主要在平滑肌细胞浆中发挥作用，分泌到血浆中量少，通过测血浆中cGMP浓度，观察两者差异可能不明显。本研究表明，移植术后长期服用Lyc可以改善受损的血管内皮功能，抑制平滑肌细胞增殖迁移，可能的机制之一是通过上调NO-cGMP通路。此外，移植血管内皮受损后，还可导致多种炎症细胞局部浸润，刺激血管内膜增生，激活平滑肌细胞增殖和迁移。所以局部炎症反应也是促进移植物血管病的重要机制之一。Lyc可以通过抑制TNF-α诱导ICAM-1的表达，减少炎症细胞局部浸润[5]。

通过本实验，我们发现番茄红素可以改善移植血管慢性排斥反应的早期改变，其可能的机制是通过上调NO-cGMP通路和抑制炎症细胞局部浸润。

[1]HAYRY P, AAVIL E, SARWAL M, et al. Chronic rejection: prospects for therapeutic intervention in fibroproliferative vascular disease[J]. Exp Clin Transplant, 2003,1(1):35-38.

[2]DIMASCIO P,KAISER S,SIES H.Lycopene as the most effective biological carotenoid Singler oxygen quencher[J]. Arch Biochem Biophys,1989,274: 532-538.

[3]HONG Z G, KAMPMANN J, KONG L. Decreased transplant arteriosclerosis in endothelial nitric oxide synthase-deficient mice[J].Transplantation,2010,89(5):518-526.

[4]唐湘宇, 王蕾, 郭芳, 等. 番茄红素对兔动脉粥样硬化形成和氧化损伤的影响[J]. 中国心血管疾病研究杂志, 2005,13(6): 462-464.

[5]HUNG C F, HUANG T F, CHEN B H,et al. Lycopene inhibits TNF-alpha-induced endothelial ICAM-1 expression and monocyte-endothelial adhesion[J]. Eur J Pharmacol,2008,586(1/3):275-282.

Lycopene Improves Endothelial Function Vasculopathy of Rat

XU Ziqiang， ZHANG Yan, SHEN Longjie

(Transplantation Center,First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

Objective The purpose of the current study was to evaluate the effects of lycopene on chronic allograft early vasculopathy. Methods Rat abdominal aorta transplantation was performed between Brown-Norwai rats as donors and male Male Lewis rats as recipients. The recipients were divided into 2 groups: Group A (BN-Lewis):that was no treatment; Group B (BN-Lewis) that received lycopene (30 mg/kg per day). Rats were humanely killed at 28 days after surgery. The grafted aortas were analyzed by histology and immunohistochemistry analysis. Plasma of mice was test by elisa. Results The aortas intimal of group B were significantly thinner compared with group C. iNOs protein expression in the group B were significantly higher than those in group A. Conclusion Lycopene has positive effects of chronic allograft vasculopathy.

lycopene；graft occlusion； transplantation

1006-446X(2016)03-0025-03

2015 - 12 - 10

温州市科技计划项目(Y20120157);浙江省自然科学基金(LQ16H100002)

TS 202.3

A